实验室里最让人头疼的事之一，就是二抗出了问题。
要说这事呢, 并非是那种能震天动地的大事情, 然而却是这样的情况——你费尽心力做了长达几个星期的实验, 进行了好几次跑胶操作, 接连转了好多回膜, 好不容易到了最终那一步, 可结果呈现出来的背景脏兮兮的, 就如同抹布一般。你直直地盯着那张图, 内心有一万只羊驼奔腾而过。
接下来, 你对一抗产生怀疑, 对封闭液持怀疑态度, 同时, 对洗膜的规程也有所怀疑, 甚至怀疑自己的手在前一天未曾清洗干净。最终, 你才发觉, 原来是二抗层面出现了问题。
之前我是这般模样，进行了将近三年的实验, 对于二抗此物, 始终认定它仅是个配角, 而那一抗才是主角呀, 一抗决定了特异性, 二抗难道不就是个打工的吗? 而后遭受了现实极为严厉的教训。
二抗是什么？真的只是个打杂的吗？
好比这样讲, 一抗是那个识别出目标蛋白的侦探, 二抗则是那个携带着荧光标记或者酶的搬运工 , 侦探找寻到了目标，然而你没办法看见他, 得要搬运工扛着信号源过来, 你才能够知晓侦探在何处。
但问题在于，搬运工太多了，容易走错门。
那背景污染的根源便在于此。二抗与膜上的其他蛋白产生交叉反应, 会致使信号混乱。二抗和一抗的重链轻链发生交叉反应, 亦会导致信号混乱。二抗甚至和封闭液里的成分发生交叉反应, 同样会造成信号混乱。我曾目睹有人所使用的二抗稀释比例为1: 5000, 然而背景却深得仿若夜空。之后更换了另一个牌子的二抗, 即便稀释比例为1:10000, 背景却干净得出奇。
什么原因导致的二抗背景高？
我当初针对这个问题, 查阅了好多资料, 向师兄师姐咨询, 之后自己逐步尝试, 最终得出结果。
首个原因在于二抗自身的纯度, 在市面上, 部分二抗属于粗提的, 其中存在众多杂乱无章的蛋白。于购买时, 看似价格低廉, 然而每次进行实验时, 却都需要耗费更多时间去调试条件, 经核算后反倒更贵。高价未必全然优良, 不过太过便宜的确实存有问题。
第二点是交叉反应, 你所进行实验操作的是鼠源一抗, 所运用的是抗鼠的二抗, 按照常理来讲的话应当是匹配的, 然而要是你在此之前使用兔子的血清进行过封闭处理, 又或者你的样本本身包含有许多内源性免疫球蛋白, 那么二抗就极有可能会产生非特异性结合。
第三个方面涉及到保存的问题, 二抗这种物质极为娇弱，反复进行冷冻和解冻的操作会致使其活性下降, 甚至还会产生团聚体, 而那些团聚体乃是造成背景污染的元凶之一, 在我有过一次教训之后, 所购买回来的二抗都会被分装到小的管中, 放置在零下二十度进行冷冻保存, 每次取用一管, 绝对不会再将用过的放回去。
怎么选合适的二抗品牌？
实实在在讲, 如果要问的话, 这个问题是不存在着标准的答案的。每一个人所进行的实验是不一样的, 样本是不一样的, 检测的方式是不一样的, 这些之下适合的自然是不一样的。
但有一个原则可以分享——别只看价格。
我曾经因贪图便宜购买了一个国产的小品牌产品, 使用两次后, WB结果糟糕透顶。后来更换为另一个属于中高端范畴的牌子, 虽说价格较为昂贵, 然而其效果稳定得出人意料。并非是声称国产的一应皆不行, 而是针对二抗这种关键试剂而言, 一分钱一分货此处所言确有其合理之处。
再一个提议是先尝试小包装, 好多品牌都设有试用装或者小包装, 花费几百去买回来试用, 倘若效果欠佳也不会亏损过多, 向实验室的师兄师姐询问一下, 询问下他们所使用的品牌、很大概率是已经被验证过的。
二抗稀释比例多少合适？
这个我真的要说一句——没有绝对的标准。
按照说明书所写的, 无论是1:5000, 还是1:10000, 这统统都只是参照。你的样本, 你的一抗浓度, 你的检测系统, 这些都会对最佳稀释比例产生影响。
我的做法是, 拿到一个全新的二抗, 率先去做一个梯度方面的实验, 将1:2000、1:5000、1:10000、1:20000这四个梯度进行一次实验性的操作, 查看一下究竟是在哪一个浓度的情况下信号才是最强的, 背景又是最为干净的。这般做会花费一次实验的时间, 然而后续却能够节省许多的时间。
实际上, 稀释比例稍微提升一些反倒更为优良。我曾目睹有人采用 1:2000 的稀释方式, 背景显得格外深邃, 随后将其调整为 1:10000, 尽管信号略微减弱了少许, 然而背景净洁了许多, 把曝光时间延长一些便能够瞧见清晰的条带。
二抗的保存期限有多久？
这个问的人挺多的。
二级抗体通常规定要在零下二十摄氏度予以保存, 需防止反复经历冷冻与融化。开启包装之后, 要是保存状况良好, 多数二级抗体能够使用至有效期限到来之时。不过存在一个问题在于, 诸多实验室里的冰箱常常处于开启以及关闭的状态之中, 箱内温度并非稳定不变, 二级抗体的活性也许已然出现了下降的情况。
我的经历所得出的经验是, 开封之后在半年以内将其用完是最为适宜的。要是超出了半年的时间范围, 尽管也许仍旧能够使用, 然而其效果将会出现降低的情况。你极有可能会察觉到曝光的时间正在变得越来越长, 信号也在变得越来越微弱, 在这个时候便是二抗快要失效了。
还有一个细节, 二抗稀释液最好是当下配制当下使用, 而不要预先配制好放置着。稀释之后的二抗在4摄氏度放置几个小时尚可, 放置一整个晚上活性就会降低。我先前贪图简便, 配制好一瓶稀释液放进冰箱留到第二天使用, 结果效果显著差了一大截。
二抗和一抗的匹配问题
这个其实说白了就是对号入座。
若你所做的是针对小鼠的一抗, 那么便需要使用抗小鼠的二抗。要是你做的是关于兔子的实验, 那就得使用抗兔子的二抗。然而问题在于, 存在一些实验, 会用到多种不同来源的一抗, 比如说会同时使用了来自小鼠和兔子的一抗, 这样一来, 那与之对应的二抗就需要分别进行选择, 或者使用具备多重检测功能的试剂盒。
更让人感到麻烦的是, 存在着这样一些情况, 部分一抗是来源于鸡的源头的, 然而在市面上, 源自鸡的二抗可供选择的数量是比较少的, 当遭遇到这种状况的时候, 我一般情况下会首先去查询一下是不是存在与之相对应的二抗, 要是不存在的话, 那就更换一抗的来源。
另存在一个不常见的细微问题, 设若你的样本之中本来就有与你一抗来源相同的免疫球蛋白之形而就此状态下二抗有可能会径直结合样本里的内源性抗体, 从而引申出造成非专业性信号之情形 举例来说假设所作属于小鼠组织 且运用小鼠的一抗 进而再采用抗小鼠的二抗 依此则二抗会径直去结合组织里所有的鼠源性质的抗体 如此这般整个背景都会呈现发亮的状况。
某次, 我踩过此坑, 之后, 将其更换为以生物素进行标记的检测系统, 借此绕过了该方面问题。
最后说几句
二抗此物, 看似平凡无奇, 然而实验之成败常常取决于这最后的关键步骤。花费时间把二抗挑选妥善且运用适宜, 相较于多次重复进行实验而言, 要划算许多倍。
历经这么长时间我亲自使用, 最深切的体会便是, 千万别惧怕尝试出错误。各个实验室的状况存在不同, 他人所采用的办法不见得就符合你。多多尝试多种状况, 探寻到归于你自身的最佳解决办法, 往后便能顺畅起来了。
噢, 没错, 另外还有这样一点, 二抗在进行曝光以前必须要避免光线照射进行保存, 存在一些带有荧光标记的二抗, 一旦遇到光线它们就会发生降解, 信号就会直接消失不见。我最开始的时候根本就不清楚这一点, 在做免疫荧光的时候开着灯去配制二抗, 结果拍摄了好长段时间什么都没有看到, 直到后来才明白原来是光线把它给破坏了。
讲起来全是血泪, 然而仔细思索, 实验这类事情, 哪一个不是在磕磕绊绊中历经波折才过来的呢。
就这样吧，希望对你有用。
