说实话，我刚接触这玩意儿的时候，心里是打鼓的。
虽说PCR, 可谁又没进行过呢。起步起码两三个小时, 等待的过程中就会渐渐困倦, 有时跑完后查看条带却不尽人意, 心态瞬间崩塌。做实验的那些人都清楚, 时间这一事物, 在实验室里相较于试剂更为昂贵。
所以, 当有某个人跟我讲, 存在一款试剂盒, 它能够把PCR的时长缩短至半小时的时候, 我的第一个反应是——是在吹牛吧?
但后来真试了，就真香了。
半小时真的能出结果吗？
能。不是理论上的能，是我自己跑出来的。
这个东西所使用的是一种称作“快速扩增酶”的物品, 简单来讲就是酶本身开展工作的速度较快, 并不需要如同以往那样缓缓地等候。并且整个反应体系的缓冲液也经过了优化, 无需进行漫长的预变性。
我有过几回尝试, 从进行加样开始, 再到实现上机操作, 后来直至通过电泳看到条带, 大致而言也就是相当于一顿午饭所耗费的那段时间。
过去是下午两点起开始跑, 一直到五点才可以收工。时下三点半就能够看到结果, 并且还能够赶在领导下班之前进行汇报。
会不会影响扩增效率？
这是我最担心的问题。快是快了，万一效率打折，那还不如慢点。
最后怎么样了? 我曾用它去扩增过长度为1kb的片段, 也曾用它扩增过3kb的片段, 甚至还尝试过用它扩增5kb的片段。那情况究竟如何去表述? 以条带的亮度以及特异性而言, 和普通的试剂盒相比较, 并没有什么不同之处。
有几回我使用的是那种格外难以扩增的模板, 其GC含量高到了极其离谱的程度, 平常的试剂盒常常跑不出来结果。换用了这个快速试剂盒后, 竟然一次就成功跑出来了, 我当时那时的表情大概是——就这般?
当然了, 不存在这意味着它是无所不能的情况。对于过长的片段而言, 像是那种超过8kb的片段, 依旧是推荐采用传统试剂盒的, 毕竟即便酶极为厉害也必须依照规律来行事。
模板质量要求高不高？
这个我得实话实说——不算高，但也不是啥都行。
一年前就已放置的DNA模板, 我曾尝试使用, 其纯度处于一般水平, OD值的呈现也不尽如人意, 普通PCR操作时, 有时无法成功扩增出结果。然而, 这个快速试剂盒竟然能够出现条带, 尽管亮度并非极大, 但至少可以清晰看见。
新鲜模板就更不用说了，效果跟开了挂一样。
然而存在一点需留意, 那就是倘若模板之中杂质数量过多, 举例来说, 要是存有酚或者乙醇的残留情况, 鉴于快速PCR的反应体系具备较高敏感性, 因而极容易出现问题。故而对于该纯化操作而言, 仍旧必须进行纯化处理, 切不可偷懒懈怠。
适合做qPCR吗？
这个问题我问过技术支撑。
答案是可以，但没必要。
凭什么这样啊? qPCR自身运行速度的快慢并非重点所在, 重点在于数据的采集以及荧光信号。快速试剂盒大多是针对普通PCR加以设计的, qPCR存在专项的快速qPCR试剂盒, 那种更为契合。
但是呢, 要是你仅仅是去做那种简单的半定量, 偶尔使用一番的话也是毫无问题的。我曾经实践过一回, Ct值相较于常规试剂盒提前了大概两三个循环, 这表明扩增的确速度很快。
价格贵不贵？
这个问题嘛……比普通试剂盒贵一点，但没贵到离谱。
大概一盒会贵上几十块钱, 按照反应数来计算的话, 每一个反应会贵 about 一两块。可是你思考一下, 节省下来的时间能够多去做一组实验, 又或者能够早点下班, 那个价值要怎样去计算?
老实讲, 时间等同于金钱, 特别是在追赶实验进展的阶段, 那一两块钱的价格差异, 压根算不上什么重要的事情。
储存和操作有什么要注意的？
这个我得重点说一句——别放错地方。
快速PCR扩增试剂盒当中的酶, 和普普通通的那种有所不同, 对于温度更为敏感。我有一位同事, 拿到试剂盒之后随手放置在冰箱门上, 结果开关门频次较多, 酶活性下降了一部分, 扩增效果显著变差。
其正确的做法是, 当拿到之后, 要立刻放置于零下二十摄氏度之处, 而不要放置在四摄氏度的环境下进行长期保存, 在使用之际, 需从冰箱当中取出, 迅速地取用, 之后又要马上放回到冰箱里头。
除此之外, 在进行加样操作期间, 尽可能于冰面上进行相关的步骤, 不要使得酶长时间处于室温环境之中。虽说这种酶具备耐热的特性, 然而具备耐热特性并不意味着能够承受反复折腾。
适合哪些实验室用？
我感觉, 只要在你的实验当中, PCR属于常见操作, 那么这个事物就具备尝试的价值。
高校的实验室, 企业的研发部门, 检测机构, 但凡是这些地方都可以的。尤其是那种实验安排得满满当当的地方, 还有就是一天能够进行十几二十个PCR的地方, 毕竟把时间节省下来了那就是效率。
当然啦, 要是你属于那种一个月之际才跑一两次PCR的情形, 那么使用普通试剂盒便足够了, 并不需要多花费那笔钱, 是没必要的。
最后说几句心里话
实施实验这个行为, 归根结底便是与时间展开竞赛, 倘若PCR的速度提升些许, 那么结果得出的时间便能提前一些, 如此一来后续步骤就能够更早一步启动实施, 而有时面临论文完成期限紧迫、项目交期逼近这般的状况, 同时还得赶着将结果呈现给老板以供查看, 在这些情境下所欠缺的恰恰就是那一个半小时的时间。
我并非是在表明快速试剂盒能够把所有问题都给解决掉, 然而它的确是可以解决掉一个极为现实的问题, 那就是等待的时间会特别长。
此刻, 于我的实验台上, 快速PCR试剂盒属于常备物品。普通试剂盒同样存在, 然而使用频率降低了。除非是那种格外讲究且古老的实验方法, 或者是特殊的模板, 我才会转而运用传统的。
其他时候，半小时搞定，它不香吗？
反正我是回不去了。
