实话讲, 处在刚开始进入行业的那时候, 我一直都认为ELISA仅仅是一项“添加样本-进行孵育操作-清洗板子”的如同机器般刻板的工作。
结果被现实狠狠抽了好几次脸。
同一批样本, 上午跑出了一个结果。下午再跑时, 却又换了模样, 好似实验室里那有着精神分裂症状的患者一般。
再后来, 我跟一位从事ELISA工作长达十几年的老前辈进行了交流, 他的一番话瞬间点醒了我, 他说道: “你觉得ELISA是凭借试剂盒取得成功的吗? 并非如此, 实际上它是靠着诸多细节才得以存续下去的。”。
这句话我记了好多年。
洗涤那点事，比你想象的重要一百倍
众多之人都认为洗涤这件事儿, 就是将液体倒掉, 而后添加些洗液进去, 接着又把它倒出来, 能有什么样的技术含量可言?
但恰恰是这一步，藏着最大的坑。
因你洗的程度不足, 所以背景便如同黑暗夜幕之里的探照灯那般高, 进而任何信号都无法被看见了。
你洗的力度过大, 存在将已然结合好的抗体冲散的可能性, 最终信号微弱得如同蚊子发出的细微而模糊的声音般。
有人为图省事, 用自来水冲洗板子, 真有这事, 别笑。整块板子本底高得离谱, 数据毫无观看价值。
那洗涤的这个环节呀, 实际上讲的话就是一种平衡的艺术, 你得把那些处于游离状态的物质给洗除掉, 然而呢又得让已经结合上的复合物能够稳稳地待在原本的位置上。
你追对象的时候, 是不是这样, 想要靠近, 然而却不能贴得过于紧密, 想要关心, 可是又不能让对方感到窒息。
孵育时间，真的不是越长越好
这个坑我也踩过。
老是感觉, 时间延长一些、经过过夜孵育, 抗原与抗体的结合会变得更充分一点儿, 信号也会变得更强一些。
不过实际情况是, 过度进行孵育会致使非特异性结合出现增加的状况, 你的信号的确是变高了, 然而其中存在着大量的“假信号”。
就像滤镜开太多，照片是美了，但亲妈都认不出来。
通常来说, 在三十七度的环境里进行孵育, 时长为三十分钟到六十分钟就达成条件了。要是在四度的状态下度过一整个夜晚, 那么对于封闭以及洗涤所呈现出的效果, 就需要予以更多的关注了。
别让你的样本在孵育箱里待太久，它不赶这趟。
样本处理，才是ELISA的灵魂
这是最容易被忽视的部分。
很多新手拿到血清直接往孔里加，然后抱怨结果不好。
可是你仔细琢磨琢磨, 血清当中的成分是何等复杂呀, 有补体, 有异嗜性抗体, 还有类风湿因子等等诸如此类的东西, 而这些玩意儿都会和检测系统产生交叉反应, 进而给你弄出假阳性或者假阴性来句号。
我存在一位友人, 其从事细胞因子的 ELISA 工作, 无论怎样去跑, 所得到的结果都是高值，更换了好几个试剂盒, 然而均未起到作用, 最终找寻到原因, 乃是样本当中存在异嗜性抗体在从中作祟。
用一下阻断管或者加一步前处理，问题就解决了。
莫要嫌麻烦, 你所省去的步骤, 最终都会以“数据不可用”这样的形式归还于你。
标准曲线的那些玄学
标准曲线的R²是不是一定要达到0.99以上？
理论上是。
在实际操作期间, 有时即便你多次重复去做, 结果却仅仅停留在 0.98, 此时所应检查的内容为: 你的标准品稀释是否精准无误? 你的加样枪是否已校准妥当? 枪头是否存在挂壁的情况?
并且, 标准品进行稀释之时, 不要单单去做2倍的系列, 有时, 3倍或者5倍的稀释, 能够使你避开某些梯度方面的误差。
当然, 要是你发觉标准曲线的最高点信号反倒低了, 那或许是hook效应, 抗原浓度过高, 将抗体位点全占满了, 进而致使检测信号下降了。
这个情况，稀释样本后再测就好了。
最后说点实在的
ELISA此物, 究其根本而言, 乃是一套检测体系, 然而其具备的稳定性以及重复性, 较量的是操作者所拥有的耐性, 还有细致程度。
你注意到的细节越多，你的实验结果就越靠谱。
不要觉得唯有做PCR才需进行无菌操作, ELISA也是需要无菌操作的。你手上存在的皮屑, 你说话期间产生的飞沫, 甚至实验室当中的粉尘, 都有可能变成你实验结果里的“噪音”。
这些话说出来好像很基础，但基础的往往是最容易出问题的。
就如同打篮球一般来看, 最为关键的并非是那些花哨的能够过人移走的动作, 然而主要的在于最基础的那样一下运球, 以及投篮时候的姿势了。
ELISA也是一样。
基本功不过关，再好的试剂盒也救不了你。
进行下一次ELISA操作之际, 尝试着将注意力回转到你觉得已然做得极为出色的那些细微之处。说不定会有别样的发觉。
