说真的，我刚开始接触酶标记抗体那会儿，完全是一头雾水。
什么辣根过氧化物酶, 还有碱性磷酸酶, 一堆名字劈头盖脸迎面砸了过来, 这种感受仿佛是在背诵化学元素周期表。更别说什么叫“标记”的, 还有那个叫“偶联”的, 更有称作“纯化”的, 每个词单独来看都是认得的, 可它们连到一块儿就完全不像正常能理解的人话了。
但后来做实验做多了，慢慢发现，这东西其实没那么玄乎。
酶标记抗体到底是个啥
说白了，就是一种“带标签”的抗体。
如同你于快递包裹之上粘贴有一个追踪码那般, 酶标记抗体乃是在抗体身上进行了如同“贴”上一个酶一般的操作。此酶自身原本不会发出光亮, 也不会产生颜色变化, 然而当你为其添加一些底物时, 它便能够呈现出颜色或者发出光亮。
如此这般, 原本处于不可见状态的抗体与抗原之间的反应, 便能够被我们给“瞧见”了。
为啥非得用酶，不用荧光
这个问题我被问过太多次了。
荧光抗体着实便利, 却是存在一个极为关键的问题, 那便是它会猝灭。具体而言, 当你开启显微镜观察较长时间后, 那荧光便会愈发微弱, 最终完全消失不见。倘若你期望保存结果, 那就只能拍摄照片, 然而照片放置较长时间后还会出现褪色的情况。
酶标抗体不一样。
因酶反应而产生的颜色, 或者化学发光信号, 极为稳定.被制作出来的ELISA板子, 放置几个月, 其颜色都不怎么有变化.这对于撰写论文以及做记录的人而言, 实在是太友好了。
并且酶具备放大效应, 一个抗体之上能够连接好些个酶分子, 每一个酶分子又能够催化数量众多的底物分子生成信号, 这等同于一个微型放大器, 能够将微量的抗原信号放大至肉眼能够看见的程度。
灵敏度？比荧光高好几个数量级。
怎么选酶，这是个坑
市面上的酶标抗体，最常见的两种：HRP和AP。
HRP即辣根过氧化物酶, 它具备价格低廉的特点, 有着稳定性良好的特性, 还呈现出反应快速的状态。然而，它存在着这样一个问题, 那就是它对于过氧化氢格外敏感, 一旦底物当中略微存在一些杂质, 背景就会高到令人十分害怕的程度。
AP也就是碱性磷酸酶, 它价格要贵一些, 不过背景较为洁净, 信号也很稳定。然而它存在缺点, 就是反应慢, 你必须得等。
以下是我个人给出的建议, 进行定性实验的时候, 要追求速度, 这种情况下选择HRP, 而进行定量实验的时候, 要追求准确度, 此时选择AP。
当然, 当下存在着第四代酶标抗体, 诸如聚合酶标记、纳米颗粒标记之类, 其信号状况更为强烈, 而背景方面反倒更低。然而, 就价格而言……一颗足以购得三颗常规的。那就依据预算来行事吧。
实验结果老是做不出来，为啥
这个问题，问的人最多。其实原因就那么几个：
效力失去了的是抗体, 作为酶标抗体它十分娇贵, 反复不停进行冻融, 使其处于高温环境, 暴露于强光之下, 这些情况都能够致使它失去活性, 我曾目睹有人将酶标抗体放置于冰箱门上, 每天频繁开关冰箱门, 温度一会儿高一会儿低, 仅仅一周的时间它就报废了。
封闭倘若没弄好, 酶标抗体的非特异性结合可是个极难解决的问题, 因为要是你不将膜或者板子上的非特异性位点给封住, 酶标抗体就会随意地到处粘贴, 导致背景呈现一片黑色。
洗涤并非彻底, 这一情况极具搞笑意味, 有人认为多进行一次洗涤乃是对时间的浪费, 而最终使得背景高出天际, 根本无法正常观看, 酶标抗体与之结合较为轻易, 然而将其洗下来却颇具难度, 你若不为其提供充分的洗涤, 它便会赖着不肯离去。
保存是个技术活
酶标抗体不像普通抗体那么皮实。
最棒的方式是分别装入不同小容器, 放置在零下二十摄氏度进行冷冻保存, 使用之时取出一支, 用完即刻丢弃, 切勿再放回冰箱之中。
什么？你说一支太少？那就分装成50微升每管，够用一次的量。
决坚决绝不可以反反复复地进行冻融操作。才进行一次冻融, 其活性就会下降百分之三十。而要是进行两次冻融, 基本上就废掉一半了。
另外, 被标记好的抗体最好不要长时间存放, 在半年之内使用是最为妥当的, 一旦超过半年时间, 信号强度将会显著下降低, 你将半年以前的抗体与新购买的抗体进行对比, 那种差距, 通过肉眼就能够清晰地看到。
自己做标记，还是买现成的
这个问题，得看你的需求。
倘若你仅仅是偶尔使用一两次的话, 那么建议去购买现成的, 这样做既能够节省时间, 又可以减少精力的消耗, 并且质量是具备保证的, 要是自己去做标记, 有可能会出现浪费价值几千块的抗体的情况, 甚至还会做出一大堆质量不合格的产品。
倘若你长时间去做某一个特定的检测, 又或者在市面上难以买到你所需要的抗体, 那就自行着手去做。当下存在着许多标记试剂盒, 其操作并非那般复杂, 而且成功率也是很高的。
在于自己做标记的益处是, 能够对标记比例予以把控, 举例来讲, 能够制作高标记度的抗体, 将其应用于小量样品的检测方面, 还能够制作低标记度的抗体, 把它运用在需求高分辨率的实验之中。
当然，自己做的质量，肯定不如商业化的。但胜在灵活。
最后说点别的
其实做实验这事，有时候真不是技术问题。
你去思考一下, 存在着这样一种酶标抗体, 从生产厂家开始, 一直到抵达你手中, 在这一整个过程当中会历经多少次的运输, 又会经历多少次的温度变化? 那你有没有去思索过, 你所购买的那一个批次, 极有可能本身就是属于次品的?
我存在一位友人, 接连三个月关于ELISA均无法做出结果, 更换了好些种类的抗体皆是不行的状态。而后进行一番查验, 原来是他所使用的洗板机出现了问题, 导致洗涤的程度达不到应有的彻底标准。在更换了洗板机之后, 所有状况都变得正常起来。
所以呀, 当处于做不出来的情形之下时, 千万别仅仅只是一味地盯着抗体。要对整个实验流程展开系统的排查, 通过这样有步骤的排查, 往往就能够找寻到其中存在的问题。
有着酶标抗体性质的那类是一种工具, 工具是否具备好用的特性, 一部分取决于工具自身的状况, 另一部分取决于使用工具的人。
多试几次，多总结教训，你也能做出漂亮的实验结果。
