我予以承认, 当首次听闻“荧光定量PCR”这六个字之际, 我的脑子呈现出嗡嗡作响的状态。
像一串密码。像某个实验室里才会冒出来的暗语。
但随后发觉, 这物品实际上每日都在我们身旁来回。检测新冠病毒, 依靠它做到。查验食品里有无转基因, 依靠它实现。甚至你所吃的那盘牛肉是否真牛肉, 同样能够依靠它。
讲得直白些, 那荧光定量PCR, 它就是一个“超级放大镜”, 它具备这样的能力, 就是可将微乎其微极为微量的DNA片段, 放大到那种足以让你能够看得见的地步, 而且还能放大到你可以数得清楚的程度。
为啥要加“荧光”俩字？
传统PCR也能放大DNA，但它看不见过程，只能等最后结果。
这仿佛如同这样一种情形, 你去煮上一锅汤的话, 传统PCR, 是一直等到那锅汤完全煮好之后, 才会去掀开锅盖进而知晓里面究竟包含着什么东西。然而荧光定量PCR, 却是在煮汤的整个进程当中, 每分钟都在目不转睛地盯着锅里所发生的变化——汤究竟是在什么时候开始冒出泡泡的, 那些泡泡到底有多大, 颜色有没有发生改变。
它朝着反应体系之中添加了一种具备特殊性质的荧光染料, 或者是某种探针, 伴随着DNA依次进行每一轮复制, 荧光信号便愈发明亮一些, 而机器正是依据这个亮度所呈现出的变化特征, 从而实时监测DNA数量的动态变化情况。
所以叫“定量”。不是等结束了才猜，是整个过程都在读数据。
这玩意儿到底能干啥？
你想晓得一块肉有没有掺和猪肉? 将其, DNA提取出来, 拿到机器上运行一回, 荧光信号便会把答案告知你。
你是不是想晓得, 这批种子之中的转基因成分究竟有多少呢? 按照同样的那种道理, 去进行测量一番, 这样就能够知晓了。
要是你想弄明白自己是不是感染了某种特定病毒, 那就得把病毒核酸提取出来, 然后通过荧光定量PCR进行检测, 如此一来, 阳性或者阴性的结果便会清晰明了。
它对于样品没有挑剔, 对于场景也没有挑剔, 只要你有着想要去测定某一个特定的DNA序列的想法, 它便能够帮你把其测定出来, 并且在定量方面精准得令人十分吃惊。
但有个大坑
许多才开始接触的人, 感到那荧光定量PCR乃是一种高级PCR, 任意去做就可以了。
错。
这东西最怕两件事：一是样品污染，二是引物设计不合理。
哪怕仅仅只有极其微小的一丁点外源DNA混入, 导致样品受到污染, 荧光信号便会陷入混乱无序的状态。你所认为检测出来呈现阳性结果, 事实上有可能是某个运气不佳的人不经意间打了个喷嚏所致。
引物的设计存在不合理之处, 不是扩增的效率处于偏低的状况, 就是会形成二聚体, 其结果所呈现出的曲线, 长得如同心电图一般, 以至于你根本无法做出有效的判断。
因此, 进行荧光定量PCR时, 首要步骤并非开启机器, 而是弄明白你的引物是否可靠。其次是准备好阴性对照。最后才是将其放置到仪器上运行。
数据怎么看？
荧光定量PCR输出的，是一堆曲线和Ct值。
衡量荧光信号开始显著上升的那个循环数, 被称作Ct值, Ct值比较小的状况下, 意味着起始模板量相对较大, 同时病毒或者目标基因的浓度也就越高。
好比, 有一个样品, 它的Ct值呢是18 , 另外有一个 , 它的Ct值是30。前面那个样品相比于后面那个, 在浓度方面竟然高出了几个数量级。
但是, 千万别直接凭借Ct值去进行大小对比。你必须要先开展标准曲线绘制这个操作, 进而确认扩增效率处于90%至110%这个范围之内。不然的话, 你所做的比较完全就是毫无意义的行为。
没人告诉你的小细节
对荧光定量PCR所使用的耗材而言, 千万不要用手去触摸管盖, 因为手上存在著的DNA会对样品造成污染，进而致使出现假阳性的情况。
反应体系加样的时候，最好在冰上操作，减少非特异性扩增。
用时, 以SYBR Green染料, 熔解曲线, 必须要做。Ct值而论仅靠, 当成会有可能, 产物将扩增作, 引物二聚体把。
这些细节，说明书上不一定写。但实验室的老手都懂。
它能多精确？
理想的那种状态之下, 荧光定量PCR能够检测得到, 处于10个拷贝以内的目标性质的DNA。
10个拷贝所含的究竟是什么样的概念呢? 那便是在一杯水体当中存在着只有十几个的病毒颗粒, 它竟然都能够将其找出来。
然而实际情况常常并非那般美妙。样本的质量状况, 提取的效率高低, 操作的具体手法, 这些都会对最终得出结果的精确程度产生影响。因而, 在进行定量操作之时, 必须要同步进行内参基因校正这一行为, 以此来消除操作过程中所产生的误差。
最后说点掏心窝子的话
称作荧光定量PCR的这个, 听闻其名会让人觉得很唬人, 事实上它不过是一把尺子, 一把用于测量DNA的尺子。
你只要知道：样品里有没有你想找的序列，有多少，就够了。
别把它想得太神秘，也别低估它的门槛。
它的掌握关键在于包含了三件事, 这三件事分别是, 有着干净特质的样品, 具备可靠特性的引物, 以及呈现标准化状态的操作流程。
那这三条若是达成了, 荧光定量PCR便会成其为一种极顺着人意来的工具, 要是没成功做到, 它就会摇身一变成为爱在那弄虚作假的令人不爽至极的东西。
希望这篇瞎聊，能让你少走点弯路。
