你可晓得, 当我头一回瞅见荧光PCR的曲线图之际, 硬是对着屏幕凝视了五分钟时间, 脑海里头全都是这般疑问“这究竟是个啥东西在蹦跶啥呢? ”。
出身并非科班的人, 真的会被那些曲折迂回的扩增曲线弄懵圈。诸如“Ct值”, 还有“荧光阈值”, 以及“基线期”, 再有“指数期”等等, 一堆术语扑面而来, 感觉好似在看天书。
但说实话，这东西没你想的那么玄乎。
荧光PCR检测到底是个啥？
用通俗易懂的话来讲就是: 你拥有某样物品, 其数量极为稀少, 稀少到压根无法检测出来。荧光PCR恰似一台“复印机”, 将那样物品不断复制达几百万份之多, 一直复制到你能够看见它的时候。关键的问题在于——它究竟是如何知晓自身复制了多少份的呢?
靠荧光。
每进行一次复制操作, 便有极细微的荧光信号显现出来, 复制的数量越多, 荧光的亮度越明显, 仪器专注于这亮度的变化情况, 绘制出那条令你看了感到头疼的曲线。
就这么简单。
为什么有时候Ct值高有时候低？
针对此事, 我着实必须认认真真地谈一谈。众多人一旦瞧见Ct值处于35以上, 便会惊慌失措, 暗自思忖是不是出现了什么状况。然而, 你不妨静下心来仔细琢磨琢磨, 倘若你着手去抄写一份文件, 首份耗费了10分钟, 第二份用时8分钟, 第三份仅用了6分钟——这并不意味着文件自身发生了改变, 而是由于你的熟练程度得到了提升。
Ct值也是这个道理。
它所反映的, 是你自开始起直至检测到荧光信号时, 所经历的循环个数。若信号出现得晚, 那么Ct值便大；若信号出现得早, 那么Ct值便小。然而, 仅仅去看Ct值, 却不关注扩增曲线形态, 这就如同仅仅观察一个人的身高, 却不留意体型一样, 极易造成判断失误。
某些曲线于历经35个循环之后方才起始呈现翘头态势, 你需要认真细致地去审视那个翘头的具体形态。究竟是真实的翘头, 还是虚假的翘头? 是呈现平滑上升的状况, 还是出现突然蹦跶一下的情形? 后者有八成的可能性属于干扰。
操作中那些让人崩溃的细节
我踩过的坑比走过的路还多。
曾经有一回, 在进行加样这项操作之际, 手部出现了抖动状况, 以至于有气泡进入其中。那时并未予以重视留意, 然而后续所跑出的曲线呈现出类似心电图那般的形态, 呈现出上下起伏的态势。直至后来方才知晓, 原来在反应进程当中, 气泡发生破裂, 这种破裂会释放出额外的荧光, 从而致使你误以为出现了阳性信号。
又有次之情况, 盖子未严实盖合。致使整个仪器发出警报, 进而所有样本皆完全报废。就在那天夜里, 我于九点起重新开展工作, 持续至凌晨两点。
难道你是在讲细节无关紧要吗? 那每一个具体的动作, 都明确决定着所涉曲线究竟是呈现出美观的形态, 还是展现出难看的模样。这其中涵盖了移液枪操持时的垂直程度, 还包含加样之后是否有轻柔地弹击管壁, 从而促使液体汇聚至底部, 另外也包括离心那特定的短暂15秒, 到底有没有以认真的态度妥善完成。
试剂保存这件事比你想得重要
好多人下意识地认为, 把试剂放置到冰箱里面就万事大吉。可是你是否清楚理解, 荧光PCR的关键核心构成成分, 具体来讲就是那些聚合酶以及探针, 它们本质上全部都是蛋白质。而蛋白质这么一种物质, 它可是相当挑剔, 极其讲究, 特别难伺候的！
反复冻融，它就变性。
温度不稳定，它活性下降。
光线下暴露太久，荧光基团自己就先灭了。
我有过一次经历, 见到过一间实验室, 有一盒试剂放置在冰箱的门上, 每天都要频繁开关冰箱门, 而那个特定位置的温度波动情形最为明显, 最为突出。正是由于这样的状况, 那一批试剂的灵敏度呈现出直线下滑的态势, 所做出来的Ct值普遍超出正常范围, 偏大了2至3个循环。你会去思考, 这究竟算是试剂本身存在问题呢? 实际上从本质上来说, 这是保存方面出现了问题。
结果判读能不能再客观一点
讲起来蛮有趣味的, 荧光PCR原本是由机器来完成的工作, 然而到了最终判定解读结果之际, 却还是得依赖人眼。
为什么？
仪器存在误判情况, 有时自动分析软件将基线设置错误, 把阴性样本判定为阳性；有时扩增效率过低, 软件却无法识别。此时就需要人员去调整那条阈值线。
难道判断标准事实上当真只有三条吗: 其一, 扩增曲线究竟有没有呈现出显著的S型? 其二, 荧光信号到底有没有达到阈值? 其三, Ct值是不是处于正常范围之内? 然而关于第三条却存在着一个前提条件——即你是否清楚正常范围究竟是多少。因为不同的机器, 不同的试剂盒, 还有不同的实验室, 这个范围是能够相差许多的。
所以别拿别人的标准往自己身上套，你得有自己的对照。
荧光PCR的三种类型你会分吗
很多人用了三年荧光PCR，都没搞清自己用的是哪种。
第一种是SYBR Green法, 它属于染料式的, 任何人都能够进行染色, 其具备操作简单且成本低廉的特点, 然而特异性却有所欠缺。第二种是TaqMan探针法, 它有着精确打击的特性, 特异性十分强, 不过探针的价格较为昂贵。第三种是分子信标, 它并不常见, 但是存在有人使用的情况。
你猜猜如今市面上百分之九十的商品化试剂盒所采用的是哪一种呢？是TaqMan。这是由于其具备稳定性 , 是因为其拥有良好的重复性 , 是因为其不容易出现非特异性扩增的情况。然而要是你所进行的是科研工作 , 想要去探索未知的事物 , 那么SYBR Green反而会更适宜 , 这是因其不挑剔。
这个选择，取决于你在干什么。
污染控制比你想象的更头疼
荧光PCR最怕什么？污染。
怕的并非是灰尘掉入其中, 而是你所制作出来的物品飘逸至空气中, 每回开启一次管子, 管内几百万份的扩增产物便存在着可能会逸散出去的情况, 下次再度开展实验时, 这些物品飘入新的反应管内, 会恰恰给你造成一个假阳性结果。
所以分区的这种操作并非是形式主义, 试剂准备的区域、样本需要处理的区域、进行扩增的区域、产物分析的区域, 这四个区域是被物理方式隔开的, 就连你所穿着的白大褂都不可以混合着来穿。
亲眼目睹极为离奇之事: 有人竟将经过扩增处理后的管子带回试剂准备区域。随后, 紧接着的一周时间里, 所有阴性对照皆呈现阳性状态。经过连续三天的仔细排查, 方才找出问题所在。
为什么你的曲线总是乱七八糟
别急，我帮你梳理一下最可能的原因：
模板加多了，荧光信号过早饱和，曲线变成平头。
模板加少了，信号迟迟不来，曲线跟阴性对照躺一块儿。
引物设计不合理，非特异性扩增，出现多条峰。
退火温度不对，要么没产物要么乱产物。
镁离子浓度不合适，影响聚合酶干活。
瞧见了吗? 每一个环节都将会致使你遭遇失败而归的状况。并且最为可怖的是, 偶尔会有多个问题一同呈现出来, 你根本就不清楚应当率先去处理哪一个问题了。
我所采用的做法乃是, 首先去查看阴性对照, 阴性对照呈现干净的状态, 方能够表明试剂以及操作不存在问题, 接着再去查看阳性对照, 阳性对照处于正常的情形, 这意味着反应体系不存在问题, 最终才去查看样本, 逐个进行排除, 千万不要一开始就无端怀疑人生。
荧光PCR检测的未来会往哪走
说点个人看法。
现今的荧光PCR已然足够成熟了, 然而却仍朝着两个方向去竞争: 其一乃是速度更快, 其二更为便于携带啦。
在那个更快的取向之中, 出现了被称作快速PCR的事物, 它将原本长达一个半小时的流程, 压缩至30分钟之内。究竟是凭借怎样的方式达成的呢? 是提升升降温的速率, 对聚合酶予以优化, 削减循环的次数。然而其中所付出的代价便是灵敏度会有所降低。
更为便于携带的方向, 表现为那种与手机尺寸相近的小型机器, 搭配干粉试剂, 即便在野外环境也能够进行操作。然而, 存在的问题是, 低温保存这一状况依旧无法得到解决, 热循环的稳定性同样也稍显不足。
甚至说那种能够完完全全替代荧光PCR的技术, 比如说数字PCR、等温扩增此类, 从当前的情况来看, 还没有哪一个能够切实达成。数字PCR它的精度是很高的, 然而其成本同样也高, 等温扩增速度很快的, 只是极易发生污染。它们各自都存在着自身的不足之处。
所以至少在接下来的三五年，荧光PCR还是那个“金标准”。
直至写到末尾之际, 陡然间忆起, 十年之前我头一回开展荧光PCR时, 师兄对我讲了一番话语, 那时的我没能领会其意, 然而当下却觉着无比正确: “切莫被那些曲线给唬住, 它仅仅是在向你表明它所目睹到的情形罢了。而你才是那个能够决定它究竟看到了什么的人。”。
嗯，大概就是这个意思吧。
