谈起这个, 从事动物实验这一领域, 哪个人没有与ELISA试剂盒有过几次冲突呢。
头一回的时候, 我实实在在地觉得这东西就只是“加样, 孵育, 洗板, 读值”这般简易而已。说明书讲得条理清晰, 步骤画得一目了然, 像我这种动手能力差的人照着做总不会错吧? 可真是太幼稚了。
在进行小鼠血清的IL - 6检测时, 首次出现了翻车情况。结果呈现出的那个曲线, 该怎么形容, 恰似我的人生那般, 毫无规律可言。空白孔的数值高到很离谱的程度, 标准品跑出来的样子如同心电图。当时我差一点就把酶标仪给砸了。之后找负责技术支撑的哥们儿交流, 人家的一句话瞬间点醒了我: 你在洗板的时候, 有没有泡沫残留?
没有？不对，其实有的，只是我没注意到。
在拍板之际, 那种微小得难以察觉的气泡, 根本无法看见, 然而它们确实存在于那里, 以一种悄然无声的状态, 对每一个孔的反应进行破坏, 就这样我的数据因此而覆灭, 自那之后, 每一次洗板之时, 全都需对着灯光予以检查一番。
到底怎么选动物ELISA试剂盒才不踩雷？
这个问题我问过自己一百遍了。
那些在市面上售卖的试剂盒, 价格有便宜的, 便宜的只需几百块, 也有贵的, 贵的要大几千。对于那些价格便宜的试剂盒, 你敢去购买吗? 反正我是不敢再买了。曾经有一回为了贪图省钱所以买了某家的试剂盒, 当它寄过来的时候那个包装, 冰袋都快要融化了, 如此下去抗体活性到底还能剩下多少呢? 我心里对此一点底都没有。
但是贵的一定好吗？也不一定。
重要的是看这两点: 其一, 交叉反应率是否有人做过? 以你所测的小鼠细胞因子而言, 血清中存在着牛血清白蛋白残留, 这会不会产生干扰? 其二, 灵敏度究竟是多少? 有些厂家标注得极为好看, 然而实际使用时, 低浓度样本根本就测不出来。我确实吃过这样的亏, 真的, 那一批样本都白做了。
存在一个细节情况, 那便是标准品的稳定性方面。存在这样的情况, 有的试剂盒当中标准品溶解之后, 很快地就会发生降解现象, 此时你必须要做到现配现用才可以。又存在另外一些情况, 有的标准品冻存之后仍旧是能够被使用的, 然而你需要去进行验证才行。千万不要轻信说明书上所写的“可反复冻融三次”这种说法, 那是处于理想条件之下的情况。而实际在实验室的冰箱环境里, 你根本不清楚门已经被开关了多少次呀。
为什么我的标准曲线总是歪歪扭扭的？
这个问题，我怕不是能写篇论文。
原因最为常见的那种情况, 是在进行加样操作时手部出现了抖动现象。我对此所说的是真实不虚的内容, 进行ELISA实验这一活动, 实际上就是一项对手部稳定性有着考验要求的工作。当你按压加样枪使其向下的时候, 即便只是速度稍微快那么一点点, 便会产生出气泡来。气泡往液面的顶端上升, 它却不破裂, 那么这个孔所对应的OD值就会变得无效了。
存有另外一种情形, 那便是孵育时温度并非均匀一致。你将板子放置于摇床上, 自认为不存在问题。然而倘若摇床的转速并非均匀, 或者板子未加盖盖子, 致使边缘孔的蒸发速度较快, 那就糟糕了。对于边缘效应这个词汇, 进行过 ELISA 操作的人都明白。
有这么个事儿, 就是洗板。我瞅见有人犯懒, 洗板机只用一次就结束了操作。嘿, 大哥, 那残留的未结合抗体, 能把你的本底给拉高到天上。起码得五次, 这可是最低标准。并且在最后一次拍板之际, 得使用干净的吸水纸, 拍到完全干燥, 肉眼都看不见液体才可。
样本处理这一步，决定了你实验的成败
这话不是我说的，是我那个做了二十年ELISA的导师说的。
不少新手一开始就去测血清, 全然不顾是否溶血。溶血的样本呈现出红色, 其中含有的血红蛋白会对酶促反应产生干扰。待结果出来后, 出现了大量假阳性。另外还有脂血样本, 其呈现奶白色, 添加进去后背景噪声会把人彻底弄疯。
组织匀浆进行处理之际会更为繁杂, 你匀浆完毕之后是否要开展离心操作, 其转速应当是多少, 在选取上清时是否要避开脂质层, 这些相关问题在开展操作之前并未构想清晰, 待后续数据呈现出来后, 你根本就无法予以解释。
如今我的习惯为, 针对每一个样本都实施一次预稀释。不清楚目标浓度范围是怎样的情况? 那就先行开展一次梯度预实验。虽说会多耗费半天的时间, 不过起码不会出现全部失败的状况。
那些年我遇到的奇怪现象
曾有一回, 我同时进行两块板的操作, 针对同一批样本, 使用同一个试剂盒。结果呢, 一块板得出的数据堪称极为出色, 而另一块板却全然报废了。那时我简直对人生产生怀疑了。随后经过查找发现, 原来是其中一块板在进行孵育操作时, 盖子未能盖得足够严实妥善。仅仅就那短暂的一会儿时间, 板子里面的液体出现了一部分蒸发的情况, 进而导致浓度发生了改变。
又有一回, 我所使用的二抗乃是新的批次, 然而我并未开展预实验。结果呈现出的那个背景, 黑乎乎得犹如锅底一般。自那之后, 任何新批次的试剂, 哪怕其与旧批次完全相像, 我还是要进行一次小试。不然内心就会感到不踏实。
唔, 想起来了, 那时又发生过另一次情况, 我在进行读值操作之际, 居然忘掉去调节波长, 要晓得酶标仪其默认的波长是450nm, 然而我所使用的那个试剂盒是采用双波长检测方式的, 这就要求得扣除630nm的本底才行, 最终呈现出来的OD值高得令人咋舌, 我当时还误以为自己察觉到了什么具有重大意义的突破, 嘿嘿。
如何判断试剂盒的真伪和好坏？
这个问题，其实挺敏感的。
在市面上存在着一些试剂盒, 并不能直接分辨出其质量好坏, 这些试剂盒实际上就是将来自其他厂家的原液进行分装, 仅仅是更换了包装、贴上本厂牌子那么简单, 然而其价格却翻了一倍。那么究竟该如何去分辨呢? 首先要看批间差, 对于同一批次的试剂盒而言, 若其CV值超过了10%, 那就应当赶紧更换。此外, 还要看质控品, 质量较好的试剂盒会附带高、中、低三个浓度的质控品, 当你使用质控品做完检测之后, 检测结果应该落在给定的范围之内, 如果结果不在给定范围内, 那就表明该试剂盒存在问题。
这是一方面, 要看技术的支撑情况。你往那边打一通电话过去, 对方可不可以迅速地对你的问题作出解答呢比如说? 倘若对方含含糊糊讲不清楚, 又或者给你一些意思不明确、似是而非的建议, 那么对于这个品牌, 你最好是别去接触。
我当下所拥有的经验表明, 宁愿花费更多的金钱, 去购置那些拥有良好口碑的、具备技术团队的品牌。毕竟一旦实验出现了问题, 你起码能够清楚知道该去责怪谁。
保存和使用，这些细节别忽视
ELISA试剂盒最怕什么？热和反复冻融。
拿到货物之后, 即刻去检查冰袋, 要是冰袋全都融化了, 试剂盒的温度超出4度已经很长时间了, 那么其活性必定会有损失，不要吝惜钱财, 径直去退货。
该试剂盒当中所包含的各个组成部分, 存在部分属于浓缩液体形态, 是必须予以稀释操作的。而在进行稀释这一行为动作之际, 究竟应当选用何物作为稀释剂? 是蒸馏水吗? 亦或是超纯水? 又或者是PBS? 产品说明书里面已然有所记载说明, 然而却有相当多的人并不去查看阅读。我曾经目睹过有人竟然使用自来水来对洗涤液实施稀释——在那一刻我当场内心就想着要给他跪下来。
另外, 所有的试剂在使用之前都需要恢复至室温状态。要是直接从4度拿出来就进行加样操作, 由于温度不均匀, 那么反应速率就会不一致, 如此一来结果能准确才怪呢。
最后说点真心话
一直在做动物ELISA已经好多年了, 我有着这种莫大的感受, 那就是, 对于这个实验来讲, 它并非是技术方面的相互较量, 而是耐心方面所展开的较量。
你在加样之时要具备耐心, 在洗板之际需做到仔细, 对于孵育的时长务必严格把控, 如此一来结果通常不会太过糟糕。那些出现问题的经历, 九成都是源于某个环节过于急躁所致。
并且, 千万别对任何一款试剂盒盲目迷信。不存在毫无瑕疵的试剂盒, 仅仅存在适宜你实验体系所用的试剂盒。你需要去做的事情, 便是寻觅一款具备稳定可靠特性的, 接着构建一个契合自身情况的SOP。严格依照这一SOP去操作, 随着时间的推移, 你方可透彻了解它的特性。
当初我所用的那个品牌, 讲真, 初始阶段也曾遭遇波折。然而我同他们的技术支持人员相熟之后呢, 其传授赋予我多样细微诀窍。比如说, 在进行标准品稀释相关操作之际选用硅化管, 以此来降低吸附现象；比如说, 于孵育这个环节运用保鲜膜将板子包裹起来, 进而避免出现蒸发状况。
这些细微之事, 书本之中不会去书写, 说明书里同样不会去罗列, 唯有亲身经历过, 体验过失败的状况, 进行过深刻的反思, 你才能够明白。
盼望我的这般饱含伤痛的经验教训, 能够使你减少些错误的路径。实验并非轻而易举之事, 进行时要好好珍惜呀。
