这东西到底是个啥
实话说来, 荧光定量PCR此物, 初接触之际着实非常懵懂。众多术语, 诸如Ct值、扩增曲线、熔解曲线, 听闻便觉头疼。
但实际上来说, 它只是被用于“查看”到底DNA存在数量有多少的一项技术。并非是那种关于“有”或者“没有”的判断类型题目, 而是属于“有多少”的填空类型题目。
十年之前, 当我首次着手去做之时, 手部处于颤抖状态, 加样出现偏差却浑然不知, 最终结果竟是糟糕至极。
为什么你的实验老翻车
我见过太多人，做不出来就怪试剂，怪仪器，怪样本。
其实最容易被忽略的，是那个最基础的——引物设计。
引物设计到底怎么搞
许多人随意挑选一款软件, 将默认参数运行一番, 便把它拿来使用了, 随后运行出来的曲线杂乱无章。
搞引物设计这个事情, 绝对是不可以存有懒惰心理要摒弃的, GC含量需要把控在40%至60%这个范围之内, Tm值处于55℃到65℃区间是较为理想恰当的, 最为关键重要的一点是, 要躲开那些重复序列以及二级结构区域。
最大的坑被我踩过的便是身为引物二聚体的东西。就是那样的曲线, 看上去仿佛是实现了扩增, 然而一旦去跑胶, 出来的结果彻彻底底全是针对二聚体的哟。
模板质量才是王道
有一些朋友, 在试剂方面特别舍得投入资金, 然而在样本提取这件事上却敷衍了事。样本破碎的程度不彻底, 纯化的效果达不到应有的水平, 即便存在抑制剂也全然不予理会。
你想想，模板里要是混了东西，PCR扩增能准吗？
RNA提取的坑
要是做RT-qPCR, 那RNA质量可更加生死攸关了。RNase在任何地方都存在, 你的手上有, 台面上有, 甚至空气当中都有。提取完毕之后一定要去测一下260/280这个数值, 最理想的情况是在1.9到2.1之间。
存在一回我偷懒而未进行测量, 随后在进行反转录之后拿去跑, 结果Ct值相较于正常情况高出了8个循环, 就这样平白无故地耗费了一整天的时间。
反应体系别瞎调
体系是厂商所给予的, 是经过了优化的, 不要随意进行更改, 尤其是那个模板加量, 并非数量越多就越好。
增多模板会对反应起到抑制作用, Ct值会发生偏离, 我通常将其控制在50至100ng的范围, 效果相对稳定。
还有那个镁离子的浓度, 要是太低, 扩增效率就会很差, 倘若太高, 又容易出現非特异性产物。真的是必须得摸索一番。
仪器和耗材的玄学
存在一些实验室, 倾向于选用价格较为低廉的八连管, 然而其盖子以及管壁的透光率表现欠佳, 进而导致荧光信号呈现出较弱的状况。
还有那个封膜，一定要压紧。蒸发了体积变了，结果全废。
数据分析别想当然
好些人在获取到数据之后, 就径直采用默认阈值进行计算了。然而实际上, 这个阈值理应设置在指数扩增期的中间位置, 可不是随随便便的某个地方。
内参基因怎么选
选取内参并非是为了达成好看的目的, 而是去校正你操作过程当中所存在的误差。对于不同的组织而言, 对于不同的处理来说, 内参的表达都有可能出现变化。
我先前针对进行缺氧处理的细胞, 挑选了GAPDH作为研究对象, 接着发现处理组与对照组之间的差异极为显著。随后将研究对象更换为ACTB, 情况才恢复正常。
最好是预实验里测三四个候选内参，选最稳的那个。
那些血泪教训
做了这么多年，总结几个最痛的教训：
不要听信他人所说的“这个体系我运用了三年都不存在问题”, 样本具备差异, 试剂批次也存在不同, 都必须重新来进行验证。
每个板子都要添加阴性对照组, 不要嫌这样做是一种浪费, 因为一旦出现污染情况, 就会毁掉你长达一个月时间的实验成果。
必须要妥善留存好原始数据。有时你所认为的差错, 回过头去看时实际上是某一步骤存在偏差。要是没有原始数据, 那你就永远都找寻不到缘由。
没做之前得先去确认一下引物的特异性, 去进行Blast一下, 这并不是一件费事儿的事情, 然而省下来的时间足够你去做好几板了。
心态别崩
有关荧光定量PCR此物, 讲简易亦属简易, 道艰难亦为艰难。重点在于你需领会每一步所从事之内容, 而非机械性地照protocol施为。
当做不出来的时候, 不要急着去变换试剂, 先来思考一下自身究竟是哪一个环节有可能出现了问题。有时, 仅仅是换掉一个枪头, 改变一下加样的顺序这样的事情。
将那实验之类的事物, 占比中的七分用于准备, 三分才是实际去做。在前期把相关工作充分做好, 之后的一切皆是自然而然达成的事情。不要慌乱, 一步一步慢慢进行, 总归能够将其做好的。
