坦诚讲, 当我头一回听闻“荧光定量PCR”这六个字词的时候, 我的脑袋里仅仅存有一个反应——。
“什么鬼。”
有着一堆字母缩写, 还加上了“荧光”这两个字, 听起来仿佛是某种科幻电影当中的检测设备。之后才发觉, 这东西实际上并没有那么玄乎, 只是被各种各样的论文以及广告包装得太过吓人了。
今天就用大白话，把它掰开了说。
荧光定量PCR到底是干什么用的？
打个比方。
你若想晓得一碗汤之中是否放了盐, 寻常的PCR仅仅能够告知你“放盐了”或者“没放盐”。
但荧光定量PCR能告诉你——这碗汤里放了几粒盐。
明白了, 它是基于普通PCR之上, 增添了一项“数数”功能, 能够实时对反应进程予以监控, 每完成一轮复制时便做一次计数, 最终向你告知初始样本里确切含有多少目标分子。
说白了，就是给DNA做“人口普查”。
它怎么做到的？别被术语吓到
原理其实不复杂。
当你进行PCR操作时, 如果体系中添加了荧光染料或者探针, 那么随着DNA每复制一轮产生的荧光信号会逐渐增强, 此时仪器如同一位全天候紧盯监控的保安, 它会全程记录荧光强度的变化情况。
等到反应结束，看一条曲线——标准的S形。
曲线越早朝着上方翘起, 表明初始模板数目越多, 这个出现翘起的时分, 科学领域称作Ct值, 你只要理解为“警报响起来的那个时间点”便可以了。
时间越是早的时候, 病毒进而便是越多的情形。在时间越是晚的状况下, 病毒也就相应越少了。不曾出现翘这种情况, 那就是没有检测到的结果。
就这么简单。
曾经我学习之际, 因林林总总的专业术语致使头晕目眩。诸如“探针法”, 还有“染料法”, 以及“淬灭基团”, 包括“ROX校正”等等。直至如今我依旧难以全然记全。然而实际进行操作之时, 便是添加样本、将样本放置于仪器中运行、查看曲线, 此为三个步骤。
荧光定量PCR比普通PCR强在哪？
做完普通 PCR 后, 你还需要去跑一场电泳, 以此查看是否有条带出现。存在条带那便是存在, 不存在条带那便是不存在。
再者, 进行跑电泳这个步骤的时候可是极其容易产生污染现象的嗯。当你把 PCR 管的盖子打开之际, 会有气溶胶飘散出来, 如此一来整个实验室都极有可能被污染到。实验室里的师兄师姐对于这个情况可是最为厌烦的。
荧光定量PCR不用。
操作全程处于闭管状态, 自反应起始直至结束, 盖子皆无需打开, 仪器直接对荧光信号予以读取, 结果自动生成, 既省事, 又干净, 且能够进行定量。
至于定量，那就更香了。
普通PCR告诉你“有这个基因”。
荧光定量PCR告诉你“这个基因的表达量比那个高了8倍”。
一个情况是, 前往菜市场买菜时询问“有土豆吗” , 另一个情况则是询问“今天土豆多少钱一斤, 便宜吗”。二者所包含的信息总量, 是全然不一样的。
做实验最怕什么？数据不好看
我做过一段时间的荧光定量PCR，说实话，前期栽了不少跟头。
极其糟糕的一回, 制作了满满两版有着九十六个孔的检测板, 然而最终所有的数据均无法采用。其Ct数值波动幅度大得仿若乘坐过山车一般。而后经查找得知, 乃是在进行加样操作时手部出现颤抖状况, 移液器的枪头未能精准对准, 致使加样呈现不均匀的态势。
还有一次，溶解曲线出来，双峰。
双峰究竟意味着啥? 是引物二聚体, 又或者是出现了非特异性扩增。这下好了, 数据基本上算是废掉了。
后来总结了几条血泪教训：
1. 引物设计必须要严谨对待, 运用软件去运行一下二级结构, 将Tm值把控在58至60度之间, GC含量保持在40%至60%的范围, 我后来采用Primer Premier进行设计, 而后再运行一遍NCBI的BLAST予以验证, 基本上未曾出现过问题。
2. 于加样之际, 样本与试剂务必得充分予以混匀, 切不可偷懒, 要进行慢速的离心操作一下。
3. 选对植物要用的内参基因很关键, 比如Actin、GAPDH或者18S rRNA，不过不同物种所适用的并不相同。我曾目睹有人因用错内参, 导致整个实验付诸东流, 毫无成果可言。
4. 每个单次情形下, 都需要去进行阴性对照以及阳性对照的设置。要是不存在对照的相关数据, 那么其与废纸相比相差无几。
它到底有什么用？生活里处处都是
你可能觉得荧光定量PCR离生活很远。
实际上，这两年的核酸检测，用的就是荧光定量PCR技术。
没错，就是那个捅嗓子眼的。
将病毒的RNA提取出来, 把它反转录成为cDNA, 接着采用荧光定量PCR 进行扩增。要是Ct值比某个阈值小, 就判定为阳性。若大于阈值, 便判定为阴性。
这属于当下极为主要通行的, 病毒检测手段当中的一种 , 其具备的灵敏度是相当高的 , 在理论层面而言 , 能够检测出达到单拷贝等级范畴以内的目标分子。
除了病毒检测，它还被用在食品安全检测里。
譬如有这么一种状况, 要是你心里存疑这包牛肉究竟是不是实实在在的牛肉, 存不存在掺杂其他东西的情况。那就要把DNA提取出来, 运用荧光定量PCR去检测牛的特定基因片段。倘若出现信号, 便可确定是真牛肉。要是没有信号, 那就表明是假货。
还有转基因成分检测。
存在一些国家, 对于转基因食品有着严格的标识要求。要检测大豆是不是含有转基因成分, 荧光定量PCR乃是标准方法。
数据怎么分析？看这几个数字就行
拿到荧光定量PCR的数据后，很多人一脸懵。
其实就关注三个东西：
Ct值, 它所反映的是, 信号开始超过背景阈值那个时刻的循环数, 其数值越小, 意味着模板量就越多。
溶解曲线, 要查看是不是存在单峰, 单峰意味着特异性良好, 双峰则表明存在非特异性产物。
扩增呈现的曲线, 是那种呈S形状的曲线, 正常状况下的曲线应当呈现出平滑的态势, 并且其指数期要显著明显。
如果你想算基因的相对表达量，用2^-ΔΔCt公式。
公式瞅着繁杂, 实际上拿Excel便能够算出。把对照组的平均数值当作1, 实验组的数值相对于它去计算倍数变化就成了。
像对照组的Ct值为25, 内参Ct值为20 , 实验组的Ct值为23, 内参Ct值为20 , ΔCt分别是5以及3 , ΔΔCt是2 , 2的负2次方等于0.25 , 这表明实验组目标基因的表达量是对照组该表达量的四分之一。
下调了。
最后几句真心话
荧光定量PCR这个技术，说简单也简单，说复杂也复杂。
其简单之处在于, 此原理并非难以领悟, 乃是为DNA分子进行计数量。其复杂之处在于, 实验操作设有诸多细节, 稍有不慎便会遭遇失败。
但是, 倘若你确实真心实意地想要深入透彻地掌握它, 那就不要仅仅只是看书。要前往实验室去做上几次, 经历几次失败, 如此一来就什么都能够明白了。
我直至如今仍清晰记得, 首个时候做出了好看的溶解曲线, 观看见单峰的那一刹那间, 人的整个状态心情愉悦得以持续了一整日。
那种感觉，比论文被接收还爽。
