不骗你，我第一次拿到这玩意儿的时候，内心是怀疑的。
实验室当中, 用过的试剂盒, 少说也有几十种了, 每一次, 看到包装之上印着“快速”这两个字, 心里边就会自动把它翻译成“多等半小时”, 所以, 当同事把那个白色的盒子, 扔到我的桌上, 说“这个只要二十分钟”的时候, 我差一点就笑出声来。
二十分钟？你当我没做过PCR？
然而, 像我们这般从事研究工作的人, 最为突出的问题便是嘴上生硬不肯轻易服软认错, 手上动作却十分麻利迅速地去撕开包装了, 嘴上还依然说着不相信这样的话。
结果呢？
结果便是, 此刻我正坐于此处, 恰似那才发觉新玩具的孩童一般, 抑制不住内心想要跟你们絮叨絮叨的冲动。
所谓的“快”，到底快在哪？
你去思考, 传统PCR的那个流程, 它简直如同实验室版本的《百年孤独》，它漫长, 它煎熬, 你还必须盯着它, 害怕错过任何东西。
变性, 之后退火, 接着延伸, 如此三个步骤反复来回跑, 进行三十五个循环, 时间从一个半小时起步。倘若碰到那种磨叽的机器, 用时两个小时都算是快的情况。
而这个快速PCR扩增试剂盒，它改变的是整个游戏规则。
最核心的点，是它的酶。
对, 没错, 正是那个承担复制DNA任务的聚合酶。传统的Taq酶, 其延伸速度大概每秒仅仅三四十个核苷酸, 宛如一位正在慢悠悠散步的老大爷。然而这个试剂盒当中所使用的酶, 据说它是经过工程化改造的, 其延伸速度一下子飙升到了每秒上百个核苷酸。
你品，你细品。
速度提升至原来的三倍, 如此一来, 整个扩增所需的时间自然而然地就被压缩了下来。另外, 由于优化了缓冲液体系, 使得退火以及延伸能够更为迅速地达成平衡, 进而整个循环的时间便被大幅度地缩短了。
明确来讲, 是从那种绿色外皮的火车转变成为了高速列车, 终点是同一个地方, 然而在路途之上所耗费的时间精力却全然不同了。
二十分钟真能搞定？我不信
说实话，我第一次做完实验的时候，盯着那个Ct值看了好久。
26.8。
我再次瞧了瞧时间, 自添加完样品直至结果显现出来, 不折不扣刚刚好, 二十三分钟。
当时, 我的脑子里, 突然冒出来一个念头, 那是第一个念头, 这个念头是, 这东西, 有没有把某些步骤, 给跳过去, 呢?
当时赶快跑了一管先前运用传统试剂盒进行扩增得到的样本, 之后把该样本的产物拿去跑了个胶。结果是出现了两条带, 这两条带的位置呈现出完全相同的状态, 并且亮度相较于其他情况而言还要更亮上一些。
之后再度进行了灵敏度的测量, 开展了梯度稀释的操作, 自100ng朝着下方进行稀释直至1pg, 每一个梯度均都进行了三次重复的实验跑出了结果。
结果怎么着？
处于从100ng至100pg这般的区间范围, 扩增效率全都在95%以上, R²值为0.998 , 低于100pg始才开始出现偏差, 然而信号依旧能够被检测出来。
我讲出这些数目, 你们或许会觉得乏味, 然而, 那些做过PCR的人都清楚, 这样的呈现, 着实相当出色。
别跟我说特异性，这是PCR的命根子
速度快，大家最担心的就是特异性。
毕竟你跑步速度快, 倘若把那些不应该进行扩增的事物也予以扩增了, 那么这般速度快又能有怎样的作用, 倒还不如缓缓地来。
因此, 我特意开展了一次具有挑战性的实验, 运用同一组引物, 对不同物种的基因组DNA进行扩增, 分别有人的基因组DNA、小鼠的基因组DNA、大肠杆菌的基因组DNA以及酵母的基因组DNA。
正常来说，只有人的模板应该出条带。
成果究竟如何呢, 仅仅是人的出现了而已。另外三个全都彻彻底底地干净着, 甚至连一个并非特异性的引物二聚体都几乎不存在。
接下来, 我再度进行测验, 使用了高GC含量的模板。众所周知, GC含量偏高, 二级结构繁杂, 扩增存在难度。传统的试剂盒时常需要添加DMSO或者甜菜碱, 不然便无法扩增出来。
这个可进行快速PCR扩增的试剂盒, 我直接就拿去用了, 没添加任何试剂, 含量为72%的GC那个区域, 被成功扩增出来了, 并且条带特别清晰。
我当时就在实验记录本上写了四个字：有点东西。
实验室里那些没人说的痛
从事科研工作的人都清楚, 有的时候, 最能使人备受煎熬的并非实验这项活动本身, 而是那些处于等待状态的情况。
待PCR运行结束, 待胶运行结束, 待测序结果返回。一日就只有那么些时间, 你等待了一个半小时的PCR, 又等待一个小时的电泳, 半天已然消逝。
要是中间哪个步骤出了问题，那对不起，重来。
相比于快速PCR扩增试剂盒, 更令我极度兴奋不已的并非是它具备多么强大惊艳的特性, 而是它使得我无需再继续处于漫长的等待之中了。
跑完用时二十分钟, 紧接着立刻跑胶, 半小时之后得出结果。一旦有情况马上进行调整, 接着再跑一管, 四十分钟过后又开启一轮。
以前一天最多做三轮优化实验，现在可以做到六轮甚至八轮。
效率翻倍，不是吹的。
那些你可能会翻车的细节
且莫觉得更换成了快速试剂盒便一切都顺遂无忧了, 我所经历过的那些挫折, 给你们逐个儿罗列一番。
第一个，引物设计。
迅速进行的扩增对于引物所提出的要求实际上是更高的, 缘由在于反应所经历的时间较为短暂, 所以引物与模板之间的结合务必要更加快速并且更趋稳定。针对此, 我将之前在传统试剂盒上运行状况颇为正常的几对引物进行了尝试, 当把它们转换到快速试剂盒上之后, 扩增的效率显著地出现了下降的情况。
后来重新设计了一下，把Tm值稍微提高了一点，问题就解决了。
第二个，模板质量。
模板质量对于快速试剂盒的要求, 实际上比传统试剂盒更为严格, 因为其反应时间短, 不存在那么多时间去“修复”或者“绕过”模板上的那些小问题, 倘若模板出现降解或者存在杂质, 扩增效率将会明显受到影响。
所以建议上样前，先跑个胶看看模板质量。这步省不了。
第三个，退火温度。
各位请注意, 不同试剂盒所对应的最佳退火温度并非相同, 这一点要牢记。以往的条件切不可盲目照搬, 最好能进行一次梯度PCR实验, 以此来优化相关结果情况。试剂盒说明书虽给出了推荐温度, 然而由于引物不同、模板也有所差异, 因而最优条件同样存在区别有差异哈, 谨记谨记 , 标点符号要加上。
它真的适合所有场景吗？
说实话，不是。
倘若你所进行的是具超高保真度要求的克隆实验, 那么建议你选用高保真酶, 缓缓推进。快速扩增的酶, 其保真度并非不佳, 然而与那些专为高保真而设计的酶相比较, 依旧存在些许差距。
只是, 要是你所从事的是常规的基因分型, 或者是病原检测, 又或者是表达量分析, 那么这东西简直就是依照你的情况专门打造的。
尤为是那些存有需大批量去处理样本的情形, 像是临床检测这一方面, 还有食品微生物检测这一领域, 又或者是环境样本分析这一范畴。时间等同于金钱, 效率意味着生命。
最后说点实在的
这东西贵吗？
相比于传统型号的试剂盒, 它的价格要稍微高那么一些, 大概是高出了差不多三四成左右。然而, 你仔细去算一算关于时间方面的账目, 一天能够多开展好几轮实验那么多, 实际上通过平摊计算下来, 单位所需要的成本反而更低了。
并且, 节省出来的时间, 你能够用以思考，用以谋划下一轮实验, 用以撰写论文, 或者, 仅仅只是提前下班。
我们做科研的，最稀缺的从来不是试剂，不是仪器，而是时间。
倘若你当下所处的实验室依旧在使用那种耗时一个半小时的传统PCR, 那我确实真心建议你去尝试一下这个快速PCR扩增试剂盒, 不用进行多次体验, 只尝试一回便可以了。
你会回来感谢我的。
