说真的，荧光标记抗体这东西，我第一次接触的时候头都是大的。
那市面上的牌子可真是多得数都数不过来, 名字看上去就好似双胞胎那般相像, 诸如Alexa Fluor、Cy3、FITC这样的品牌不少 , 让人看得眼睛都花了。可是真正实际使用的时候 , 这才发觉并不是越昂贵便越好 , 也并非是荧光越亮就越厉害。
买荧光抗体，到底在看什么？
很多人一上来就问：“哪个荧光最亮？”
其实这是个伪命题。
荧光亮与否, 要看你的显微镜, 要看你的细胞, 要看你所拍摄的内容。有些抗体标记得极为明亮, 然而结果却是背景噪点比信号还要多, 这实在是令人崩溃至极。
我踩过坑，真的。
斥巨资购入某进口大牌的荧光二抗, 然而一旦将其放置于仪器上进行操作, 映入眼帘的竟是满眼绿光, 那种均匀程度仿若被涂抹了颜料一般。而后经过深入了解才发觉, 原来那一批货物之中荧光素与抗体的比例未能调配恰当, 进而致使非特异性结合的情况极为严重。
所以，别只看亮度，要看信噪比。
多色实验，颜色怎么搭配？
你要是做单色，其实啥都好说。但一到多色，事情就复杂了。
你或许碰到过这般情形: 有四种颜色, 拍出来之后有三种相互重叠在一起, 根本没法区分清楚。
特别是绿色以及红色, 这两条通道于多数显微镜之下是明晰的, 然而你增添了第四个颜色, 像是远红, 麻烦便产生了——远红荧光间或与红色通道存在交叉, 除非你的器械滤光片格外高级。
我的经历所得是, 在做那种具有多种颜色的事情之前, 要先去查找一下有关光谱重叠的表格, 千万不要毫无头绪不加以权衡地去随意搭配。
另外, 固定以及破膜同样是相当重要的。存在这样一些荧光素, 像是PE、PerCP, 在经过酒精固定之后会直接丧失活性。你耗费了一整天的时间辛辛苦苦地进行染色, 然而一旦进行固定, 却全都白费力气了。
选荧光蛋白还是化学荧光？
这个问题其实没有标准答案，得看你的实验类型。
若打算进行活细胞成像, 荧光蛋白当属首选, 像 GFP、mCherry 这类具有稳定特性、毒性较低, 即便盯着看上几个小时也毫无问题。
可一旦进行固定样本的操作, 化学荧光标记抗体的长处便显现出来了, 其具备亮度较高的特点, 拥有光稳定性良好的特性, 其能进行选择的颜色是多很多的。
说起来有这么一点情况, 化学荧光抗体是没办法穿透细胞膜的, 你要是觉得它可以, 那可就错, 实际上它是不可以穿透的, 必须要先把细胞膜弄破才行, 而且有些情况还得添加阻断液进去, 如果不这么做的话, 信号就会全部出现在细胞外部。
这点很多新手不知道，说明书上也不会写太细。
价格贵就一定好？
我真不这么觉得。
我的实验室曾使用过几个价位各不相同的荧光抗体, 其中价格最贵的那个, 其价钱比国产的要多出有两倍还不止。然而到底效果如何呢? 确实是好的, 可以肯定是好的, 只是却并未好到足以匹配两倍价格的那种程度。
流式细胞术, 常规的那种, 尤其如此, 只要你的抗体, 特异性良好, 荧光素, 匹配适宜, 国产的, 也完全能够达到使用要求。
但是呢, 话得这么讲, 那些进口的特定品牌, 在批次的稳定性方面, 的确是更为突出的, 这一点你必须要自行去权衡考量才行。
保存，这个真的不能省
荧光抗体最怕光、怕冻、怕反复冻融。
吾有一同事, 因贪图省事, 将抗体放置于负二十度之处, 等到使用之际便取出解冻, 然而未用完便又放归原处, 如此这般来回折腾共三次, 结果抗体径直报废, 待上机进行操作使其跑出结果时, 所呈现的信号竟比背景还要微弱。
做法正确的情形是: 进行分装操作, 放置于避光环境, 在四度的条件下予以保存。千万不要嫌弃麻烦, 麻烦这一回, 能够省心一整年。
尾声
在撰写这篇文章之际, 我事实上始终在思索, 究竟怎样的荧光抗体方可称作优良的呢?
以后我发觉, 答案蛮简洁: 契合你实验方面需求的, 便是优良的。
不要被那些华而不实的参数给糊弄住, 也不要毫无理性地迷信知名品牌。弄明白你自身的需求, 弄清楚你所拥有的样本, 弄清楚你手头的设备, 之后再去下单购买。
名为荧光标记抗体的这个东西, 说到底它就是一种工具。工具究竟好不好, 这得看你在使用的时候顺不顺手。
希望你们别走我走过的弯路。
没了。
