大概是两年前吧，我第一次在实验室看到那管荧光标记抗体。
小小一管的那种, 液体近乎透明, 拿起来对着光瞧, 啥都瞧不出来。
但你知道它有多厉害吗？
这物件朝着细胞施加放置, 而后置于显微镜之下, 整个细胞仿若被施加魔法那般, 应当明亮之处亮起来, 不应明亮之处呈现漆黑一片, 恰似黑夜当中的荧光棒一样, 但精确精细化到分子等级程度。
我那天晚上回去，翻来覆去睡不着。
在思索着一个问题, 这个东西究竟是怎样达成的, 依据什么它能够精准确切地寻找到目标, 因何它具备发光的能力?
后来我翻了无数文献，也踩了不少坑，才慢慢搞明白。
荧光标记抗体到底是个啥玩意儿
说白了，就是给抗体“装了个小灯泡”。
抗体身为蛋白质, 呈现如同 Y 字形, 它的尾巴即所谓“把手”, 科学家于把手之处, 连接上一个荧光分子。
这个荧光分子就像是GPS追踪器。
负责寻找目标的抗体, 比如针对细胞表面某特定蛋白的那般, 待搜寻到了, 此刻则紧抱上去。随后荧光分子于该处绽放光芒, 向你传达“嘿，我于此处呢”的信息。
就是这么个逻辑。
不过，说起来简单，做起来真要命。
当我头一回自行尝试之际, 出现了抗体添加过多的状况, 结果, 整个视野亮到如同白昼一般了, 什么东西都没办法看清楚。而要是抗体添加过少了, 那又是什么东西都看不到了。
那个度，真的是要命地难拿捏。
为什么非得用荧光标记抗体
有人可能会问：不就是看个细胞吗，直接染色不行吗？
你试试。
采用平常的染料来对细胞进行染色, 整个细胞都变成了糊糊状的单一颜色, 很难区分出哪里是哪些部位, 完全分辨不清。这就如同把墨水随意地泼洒到墙壁上面而后, 你能向我准确陈述墙壁原本所存在有的文字内容是什么样子的吗?
荧光的好处在于——它只发特定波长的光。
你拿出一种波长的光去对它进行激发, 它便会发出另外一种波长的光。将其与显微镜上所配备的滤光片相结合, 就能够把那些杂乱无章混在一起的光全都滤去, 仅仅看到你自己想要看到的东西。
更有甚者, 当下市面上存在着各种各样颜色的荧光, 其中包括红色的荧光, 绿色的荧光, 蓝色的荧光, 黄色的荧光, 甚至还有那远红外的荧光。
只要你选对了，就能在同一张图上，同时看好几样东西。
比如说, 去看一个癌细胞, 你能够同时对它的细胞核进行标记, 对它表面的某一个蛋白予以标记, 对它内部的某一个信号分子加以标记, 甚至还能够看出它是不是处于分裂状态。
三四个标记，一张图，清清楚楚。
我第一次看到同事做出来的那种多色成像图，整个人都是傻的。
颜色呈现出斑斓多彩的样子, 然而又呈现出整齐有序的状态, 每种颜色都象征着不一样的生物学方面的信息, 恰似观赏一幅抽象类型的画作, 每一道笔触每一处线条都具备它自身的含义。
怎么选荧光标记抗体才不会翻车
这个问题，我花了两年才摸索出门道。
第一个坑：光谱重叠。
你觉得你挑选了两个不一样颜色的抗体, 然而它们的发射光谱恰好紧紧挨在一起, 一种激发的光将另一种也顺便激发出来了。拍出来的图片呈现出——红的里面透着绿, 绿的里面泛着红, 根本没办法区分。
那么在进行选择之际, 务必要查看光谱图, 查看一下两个荧光团的发射峰是否存在重叠情况。一旦光谱重叠系数超出一定范围, 那就不要使用了。
第二个坑：荧光强度不够。
某些抗体自身荧光强度处于偏低状况, 加以抗原表达量并非很高, 所呈现出来的结果便是, 模模糊糊成一片, 能让你产生怀疑人生之感。
可采用的解决办法是什么呢? 其一, 选择譬如PE、APC这类荧光性能更亮的染料。而它们所具备的荧光突出程度相较于FITC要高出好多倍。其二, 提升放大的倍数。然而如此这般便会牵扯到下一个相关的问题了。
第三个坑：没选对抗体本身。
究根溯源, 荧光标记抗体终究仍旧是抗体。于抗体而言, 唯有其本身的特异性以及亲和力不存在任何问题, 荧光标记这一行为方才具备相应的意义。不然的话, 无论你怎样反复地施行各种操作性动作进行摆弄, 最终也仅仅只是在错误的事物之上发出光亮。
荧光标记抗体到底能用在哪
这么说吧，只要你是做细胞、组织研究的，几乎绕不开这东西。
流式细胞术，你要用它来标记细胞，把不同种类的细胞区分开来。
想要借助免疫荧光染色, 去查看蛋白于细胞当中的分布状况, 瞧一瞧它究竟是处在细胞核内, 还是跑到细胞膜上去了。
组织切片进行染色, 你需借助它去查看病理组织之中, 哪些细胞存在病症, 哪些细胞是处于正常状态的。
在我尚还是处于小白阶段的时候, 导师曾经向我提及了这么一句话, 给我留下的印象格外深刻。他说道: 荧光标记抗体, 它对于你开展生物学研究而言, 就如同是眼睛一般。要是没有它的话, 那你就仿佛是在漆黑的夜里摸索着去探寻东西, 根本什么都没办法清晰地看见。
当时不太理解，现在完全懂了。
一个小问题，也是一个大问题
荧光这东西，它会褪色。
你费尽心力完成了一部片子, 拍摄了若干图片, 打算再次拍摄, 然而却发觉——亮度不足了。
或者，你在显微镜下找视野的功夫，荧光就已经衰减了一部分。
这就是光漂白。
荧光染料不同, 其光稳定性存在差异性。存在一些光稳定性稍好的, 像是Alexa Fluor系列, 相较于传统的FITC, 稳定程度高出许多。然而, 不管是何种染料, 只要光照时间延长, 就必然会出现衰减的情况。
所以做荧光染色有个黄金法则：避光、快速、尽量少看。
操作之际, 尽可能于暗处进行, 在显微镜之下寻觅视野需迅速, 倘若着实无法达成, 那就先借助普通光寻获位置, 而后切换至荧光模式开展拍照操作。
听起来挺折腾，但习惯了也就那样。
写在最后
这般说来, 诸多言语之后, 我最深切的体会是, 荧光标记抗体此物, 观之颇具神奇之感, 然而使用之际却甚为磨人。
但恰恰是因为它磨人, 每当拿到一张漂亮的图片之际, 那种满足感, 是其他东西无法替代的。
倘若你历经一个下午, 好不容易调配出一份堪称完美的配方, 随后目睹它烧制后的色彩, 正是你所期望的那种蓝, 这般感受, 会致使人们认为先前所有的挫败、所有的等候, 皆具意义。
所以呢，如果你刚开始接触这东西，别着急。
多试几次，多看看别人的经验，慢慢来。
总会做出来的。
