这事得从一瓶试剂说起, 那试剂看起来像极了过期的化妆水。我头一回瞧见荧光标记抗体时, 脑海尽是疑问——就这模样? 是透明的液体, 没气味也没颜色, 放在冰箱里和普通矿泉水没啥两样, 你却告诉我它能让我看见细胞里的蛋白? 简直是在哄骗！
结果呢，真香了。
并非是被他人强行摁着头进行科普从而出现的真香情形, 而是我独自伫立在昏暗的房间之中, 将灯关闭, 在眼睛逐渐适应黑暗的那一分钟时间里, 整个世界的规则已然被改写。在显微镜的那一端, 绿幽幽的光线仿若萤火虫群体一般, 自细胞膜之上飘荡而出。那一刻所带来的感觉相当奇特。你说我是在观察细胞吧, 可又好似细胞在凝视着我。
其实, 挺多人, 我自己以前也算在内, 都不是特别懂, 荧光标记的抗体会做些什么事儿。
这东西到底怎么“亮”起来的？
无比简单, 简直离谱至极。如同你给一把钥匙涂抹上夜光漆, 而后让它去寻觅与之对应的那把锁一般。抗体是那把特定的钥匙, 它专门辨认一种蛋白。荧光染料是那层漆, 只是这漆并非寻常之物, 而是遭受特定波长光照后即会发光的“神奇涂料”。
你问我究竟是何种机制, 是怎样的共价键情况, 又是怎样的激发光谱、发射光谱情况, 说实话, 背诵这些名词的人多不胜数, 而真正懂得其中道理的, 是那些身处暗室之中, 当看到第一束荧光亮起便会不由自主生出鸡皮疙瘩的疯狂之人。
然而我更想要表达的是, 此物的精妙并非存在于技术自身, 而是在于它使得“看不见”转变为了“看得见”。人类对于“看见”存有一份执念, 从望远镜直至显微镜, 从X光再到核磁, 我们始终在做一件事情: 让眼睛突破极限。荧光标记抗体便是这条道路上的一个驿站, 尺寸不大不小, 却足以让人停下来舒缓一下气息。
为什么做实验总是翻车？
说一件真真切切实实在在发生过的事情, 我有一位友人, 进行免疫荧光染色这项操作, 持续了整整两个月的时间, 最终呈现出来的图像, 全部都是背景噪音, 那荧光的样子, 就好像是泼洒了一碗绿豆汤一样, 糊糊地混成了一片, 他更换了三种封闭液, 对洗涤条件进行了多达一百次的调试, 甚至还怀疑是不是因为自己手抖而加 wrong 了样品。
最后发现啥问题？抗体放太久，荧光染料早衰了。
这事儿蛮具趣味性的。我们老是觉得实验失败归咎于自身, 皆是自身技术欠佳、手不够稳当、脑子不够聪慧所致。然而实际上有时候, 就是那瓶试剂陈旧了。如同人一般, 它也会疲惫, 也会支撑不住, 也会在某一日清晨醒来发觉自己再也无法发亮放光了。
所以要是你同样在搞荧光标记这件事, 出现差错了别赶忙就去否定自身, 去查查试剂日期, 要看看储存之时温度的情况, 去问问实验室当中那个极为沉默寡言的老博后, 他或许仅仅是懒得去说, 实际上当年他也遭遇过相同的差错。
荧光褪色这事儿，到底能不能忍？
能。也不能。
讲能行, 缘由在于存在一些实验, 仅需拍摄一张照片，十秒的时间范围内, 它愿褪就褪, 不愿褪也无妨。讲不行, 乃是由于有些实验得开展三维重构, 一次扫描就得耗时半小时, 扫描至一半荧光却消失了, 你只能对着屏幕发愣, 仿若面对一位原本手握胜券却忽然溜走的对手。
可用于抵抗淬灭作用的制剂是一种具有良好特性的物品, 不过它并非在任何情况下都能发挥作用。你能够察觉到抗体与抗淬灭剂之间存在着一种微妙的如同“彼此相互怀有不满”的状况——添加了抗淬灭剂之后, 有时背景所产生的噪音反而增大了, 类似于在一场安静的交流中放入了一个使声音放大的装置。
这件事情大概就是荧光标记最为让人感到抓狂的所在之处, 即不存在完美的方案, 它始终都是一种妥协的微妙艺术。倘若你期望获得较高的亮度, 那么就必须接受其褪色速度较快的状况, 要是你渴望拥有持久的效果, 就要接受亮度较低的情形。真的特别像生活当中诸多的抉择, 就是不能既要求这样又要求那样。
多色标记，看花眼还是看明白？
三颜色、四颜色、五颜色等等实施多颜色标记之人皆为勇士, 你耗费一周时间来调节补偿, 好不容易使得四个通道彼此之间不存在串扰情况, 然而却发觉其中一个通道的背景犹如城市夜空那般高, 你不禁疑问自己: 这是我所添加的抗体效果不佳, 还是细胞自身原本就表达此蛋白呢?
没人能立刻回答你。因为细胞本身就是个骗子。
它存在说谎行为, 具备伪装特性, 会于你即将得出结论之际, 陡然呈现出一张全然不同的面容。你宣称它表达该蛋白, 它却偏偏不让你看到；你讲它不表达, 它忽然在某个角落亮得极为刺眼。从事荧光标记工作的人大概都历经过这种“被细胞戏弄了”的时刻。
所以, 多色标记这件事, 与其讲它是技术方面的活儿, 倒不如说它是一场心理层面的较量。你与细胞之间存在着那种博弈关系, 而你永远都没办法确切知道谁才是猎人, 谁又会是猎物。
流式细胞术还是成像？这是个问题。
流式能够告诉你“有多少”, 成像则能够告诉你“在哪里”, 前者如同人口普查一样, 后者好似纪录片一般。你进行了流式操作, 从而获取了一堆百分比、平均荧光强度, 其数据颇为漂亮, 论文更易撰写, 不过当你注视着那些数字的时候, 总会觉得所欠缺些什么——那些细胞究竟呈现出怎样的模样? 它们是以何种方式分布的? 它们彼此之间的关系究竟是怎么样的?
变成的模样是相反的那种。你瞅见了一张挺好看美观美丽的图, 然而你却讲不出来“具体有多少”。你在那个地方去数细胞, 一直数直到眼睛看花了眼睛, 最后发觉终究还是流式检测的方式来得更加快捷迅速。
实际上这两者压根不存在矛盾, 然而实验室经费受限, 设备受限, 时间同样受限, 你总归得挑选一个选项, 挑选哪一个? 这取决于你所提出的问题是什么, 要是想知晓有没有这种情况, 那就需依照某种方式去做, 要是想知道具体有多少, 那就开展流式实验, 要是全都想实现, 那就把两个都进行操作, 随后却发觉样品数量不足了, 这可真是典型的科研悲剧, 完全搞到一起去。
它不只是个工具
提到这个地方, 我猛地发觉荧光标记抗体颇似小时候玩的荧光棒, 过年之际掰一下, 晃一晃, 能亮一整晚, 到了第二天就变暗淡了 , 只是那时的开心是实实在在的, 如今做实验时的焦虑同样是实实在在的。
然而你认真思索一下, 那时的荧光棒与如今的标记抗体, 在原理层面实际上相差无几, 都是将光隐匿起来, 等待着被唤醒, 只是唤醒它们的, 小时候靠的是手劲, 现在依靠的是科学, 那份惊奇之感, 实则毫无二致。
要是你同样在搞荧光标记, 又或者正打算去做, 那就记住这么一点: 技术是能够去学的, 试剂是可以去买的, 然而那颗甘愿在黑暗当中等待光亮的心, 你必须得自己留存着。要是没有了它, 即便荧光再怎么亮, 也没法映照出良好的结果。
简而言之来表述, 于显微镜之下能够发光的并非仅仅只有抗体, 另外还涵盖着那些熬夜去开展实验, 眼睛紧紧盯着目镜直至快要失明, 然而却依旧在持续坚持的人。你同样也是那一束光的其中一部分, 可千万别把自身给遗漏计算了。
