实验室里最崩溃的事是什么？
不是PCR跑了八遍没结果。不是细胞污染。是二抗。
没错儿, 确实是二抗。你费尽心力孵育了长达一整天的一抗, 仔细清洗了三遍, 万分小心地添加了二抗, 然而最终结果呈现出来一看——背景居然比天空还要高, 信号却比蚊子还要微弱。你凝视着那张膜。你满心悲戚想哭。你清楚你耗费了整整一周时间所做的样品, 就这样报废了。
二抗此物, 论其大小, 既非极大 , 也不算极小, 然而它却是那般在深夜实验室中使你陷入质疑自身及周遭一切之情境的存在。
我曾进行过为期三年的实验, 期间更换了八种二抗, 每一种二抗都致使我掌握了一个新的词汇, 这个词汇乃是——后悔。
什么叫二抗
说白了，二抗就是一抗的“翻译官”。
你的蛋白安在细胞里头, 有个像特工般的一抗去寻觅它, 一旦寻到便紧紧揪住不撒手。然而, 你用肉眼瞅不见这般“揪住”。故而你得借助二抗——它携着荧光或者酶, 专门用以识别一抗。一抗缠住蛋白, 二抗缠住一抗, 接着仪器就能察觉到那个信号了。
听起来很简单对吧？
然而问题在于, 二抗夹一抗存在着选择性。要是夹错了, 那些不用关注的背景就会出现。倘若夹松了样, 信号就会变弱而不明显。要是夹得过于紧了, 非特异性结合的情况也就伴随产生了。
这玩意儿就像找对象，不能太挑，也不能随便谁都行。
为什么二抗会出问题
你可曾思索过, 为何同样的样品, 别人跑出来呈现的是清晰明了的条带, 而你跑出来却是一团黑乎乎的?
大概率是二抗的问题。
我见识过数目众多的人, 他们购买一抗选择价格最昂贵的那一种, 而二抗则随意挑选价格较为低廉的。最终所导致的结果便是, 一抗历经艰难辛苦所构建起来的特异性, 被二抗彻头彻尾地给破坏掉了。
二抗有着极为显著的特性。它的来源存在特定要求, 纯化方式有着严格规定, 标记方式也十分关键, 稀释比例更是不容差错, 假如这里面任何一个环节出现失误, 那实验结果就会如同失去控制的不羁之马, 根本无法照预期进行变化。
比如说, 兔源的二抗, 你用它去检测鼠源的一抗, 从理论来讲是没有问题的。然而要是这个二抗纯化得不够理想, 它就会去抓取你样品当中原本就存在的兔蛋白, 这样一来, 你的背景就会出现异常了。
你觉得自己所进行的是WB操作, 事实上, 你实施的却是“二抗以各种花式与背景全面结合的集合”。
二抗到底怎么选
选二抗这件事，说难也难，说简单也简单。
核心就几条：
看看一抗所属的种属, 要是一抗源自小鼠, 那就选用抗小鼠的二抗, 倘若一抗来自兔子, 那就采用抗兔的二抗, 可千万别弄混淆了。
观望你所运用的检测系统是何种类型。若采用_IF_这种情况, 那就挑选荧光标记的那种。要是运用_WB_这种方式, 那就选择_HRP_标记的那种。当提到_Ihc_的情形时呢, 就得考量你是否打算去进行_DAB_显色操作了。
看待交叉反应, 这一点很多人会予以忽略, 要是你的样品当中存在多种种属的蛋白, 那么你的二抗就有可能出现“认错人”的情况, 在这个时候就必须去选择那些经历过交叉吸附纯化的二抗。
瞅瞅稀释比例, 这可是相当坑人的。只因不同厂家所生产的二抗, 其效价差距极大。当你认定依照 1:5000 的比例已然足够时, 结果人家给出的建议却是 1:20000。当你觉得价格高的产品必然会更好用时, 没想到价格便宜的反倒使用起来更顺手。
你问我怎么知道的？都是钱换来的。试错过才知道。
那些年踩过的坑
有一次进行免疫荧光操作, 所使用的二抗无论如何都无法显示出信号。我觉得是抗体失去了应有的效果, 于是重新购买了一管, 然而情况依旧没有得到改善。折腾了长达足足两周的时间, 最终发觉问题出在稀释液上——所使用的PBS中添加了叠氮钠, 导致二抗上面的HRP遭就遏止了。
再有一回进行WB操作时, 背景黑得如同墨汁那般。更换了各式各样的封闭液, 也更换了各种洗脱液, 然而均毫无效果。最终发觉原来是二抗已经过期了——那个物品在冰箱里放置了一年半的时长, 我原本认定它依旧能够使用, 可结果它却将我整条膜都给毁掉了。
极为离谱的一回, 我开展双标IF, 两种二抗均源自兔子, 仅仅标记颜色有别。结果两个信号全然重叠。嗣后才晓得, 二抗会彼此争斗 , 你必须确保它们出自不同种属 , 或者运用经专门设计的二抗组合。
这些坑，每一步都是用实验和时间换来的。
二抗不是越贵越好
很多人觉得，贵的东西一定好。但在二抗这里，不一定。
部分大品牌的二抗, 的确是好用的, 然而其价格却高到了非常离谱的程度, 有些小众品牌的二抗而言, 性价比是很高的, 可前提条件是你必须要会挑选。
怎么挑？
别看官方进行的宣传, 而是要去察看评价, 也就是用户所给出的反馈, 前往实验室论坛那儿开展搜索, 瞧瞧其他人运用这个二抗得出的图形呈现为怎样与众不同的样子, 到底具体是什么模样的。
瞅数据, 合乎规范的厂家均会给出可作验证的数据 —— WB 的条带图, IF 的荧光图, IHC 的染色图, 别单单瞧官方所给的那一张, 前往他们的官网上寻觅详尽的说明书。
瞧瞧批次情况, 对于同一款二抗而言, 不同批次的效价说不定会存在差异, 在购买之前要问得明明白白, 厂家有没有针对批次间一致性去做验证。
讲句实在的话, 最具可靠性的办法仍是由自己去尝试, 挑选几个当作候选的, 运行一个小规模的测试, 瞧瞧哪一个信号优良、背景较低, 虽说过程比较麻烦, 然而比起被数据误导要强许多。
做实验跟做人一样
要是实验做得数目多了, 你就会察觉到, 实验达成成功的关键之处常常并非存在于那些显得“高大上”的步骤当中, 而是蕴含在那些看上去不太起眼的细节里头。
二抗就是这样一个细节。
你重视它，它就好好干活。你忽略它，它就给你颜色看。
眼下我的习惯是, 于每次购入新二抗之前, 都会先行查寻一番它与我的样品、一抗以及检测系统的兼容性。进而在小规模体系之内先进行一次试验, 在确认不存在问题之后才正式予以使用。
虽然麻烦，但值得。
毕竟, 实验这一事物, 并非是做来展示给其他人瞧的, 而是做给自己去看的。要使得数据呈现出美观亮丽的状态, 如此一来, 内心才会感到安稳踏实。
你询问我当下所使用的是何种二抗, 我不会向你告知。缘由在于, 契合我的那一款, 不见得契合你。你需自行去尝试, 去经历挫折, 去进行归纳。终有一日, 你会寻觅到那一款归属于你的二抗。
就像找到那个懂你的人一样。
