对，我就是那个天天跟荧光定量PCR打交道的人。
每天八个小时, 眼睛紧盯着96孔板, 心怀期待等着曲线向上窜动, 满心盼望着Ct值能显现出来。有时到了凌晨两点还在调试程序, 究其原因是模板运行出现故障, 非特异性扩增犹如春天里的野草那般疯狂生长。
你说荧光定量PCR准不准？
这个问题我琢磨了三年。
当我初入这一行业之时, 我竟然认为这东西乃是金标准, 是那种绝对能够进行精准定量的, 有着荧光信号存在同时还能实时进行全面监控的, 光是听闻便好像显得极为高端大气上档次。然而后续却发觉, 哎, 简直全都是布满陷阱的深坑。
荧光定量PCR到底准不准
先说说不准的情况吧。
样品品质欠佳, 一切皆枉然。核糖核酸发生了降解, 无论怎样去优化流程, Ct数值依旧会出现漂移现象。我曾碰到过最为离谱的一回, 针对同一个样本, 早上进行检测以及下午进行检测, 检测所得的Ct数值相差了2.5。2.5究竟是何种概念呢? 这意味着基因的表达量相差了将近六倍。
有引物二聚体存在。我遇见过好多人, 其扩增曲线看上去挺不错, 可是溶解曲线一呈现, 糟糕了, 出现两个峰。非特异性扩增在其中捣乱, 而你还误以为自己获取到了不错的数据。随后发文章时被审稿人直接给驳回, 那滋味可真是够酸爽的。
内参基因的挑选同样是个大难题。以往傻乎乎地仅仅晓得去用GAPDH, 而后却发觉在不同的处理条件之下GAPDH的表达量也是会发生变化的。你实施了一次药物处理, 结果内参也跟着起了变化, 那你所做的相对定量又还能相对些什么？
荧光定量PCR什么时候最靠谱
但你要说这技术完全不行，那也不对。
条件控制好的时候，它真的很能打。
什么被称作条件控制良好呢? 其一, 模板质量是达标的。其二, 引物设计是合理的。其三, 标准品是靠谱的。
我之后形成了一种习惯, 每一批次的实验, 都会先去做预实验, 查看一下扩增效率是不是处于90%至110%这个范围之内。要是R²低于0.99, 那就直接重新开始, 不会抱有侥幸的心理。
而后便是重复性, 针对同一个样本去做三个复孔, 倘若 Ct 值的差异超出了 0.5 , 那么我便知晓这板子是存在问题的, 要么是加样不准确, 要么是反应体系不均匀, 在这个时候可别偷懒, 要重新去做。
荧光定量PCR的实验员血泪史
说个真事。
在去年的时候, 做了一批样品, 为此跑了一整天, 当数据出来以后, 我的整个人的状态都变得不好了。其中, 对照组以及实验组的Ct值看上去是存在差异的, 然而, 其重复性差到了一种离谱的程度。随后, 我针对加样、程序、试剂进行了查验, 结果显示都是没有问题的。
最终发觉是反转录的那一项环节出现了差错, RNA浓度开展测定时不准确, 添加进去的模板数量实际上存在很大的差异。
从那以后，我所有样品都要跑两次反转录，取平均值。
荧光定量PCR到底怎么用才靠谱
其实说白了，任何技术都有它的适用范围和局限。
通过荧光定量PCR进行基因表达分析时, 在操作符合规范, 方法严密谨慎的情况之下, 所得到的数据切实可靠。然而，存在的问题是, 众多的人将其视作傻瓜相机来对待, 认为仅添加样本、使其运行、进而得出结果便完事大吉。
它是个精密仪器，需要你像伺候祖宗一样伺候它。
进行样本处理之时需谨慎小心, 试剂务必要维持新鲜状态, 仪器应当定期予以校准, 数据分析必须做到严谨认真。每一个环节丝毫都马虎不得。
现今我负责带领新人, 首要之事便是促使他们亲自去做一回涵盖从RNA提取起始一直到数据分析终结的完整流程, 一旦出现差错便加以纠正。在理论上夸夸其谈是行不通的, 唯有亲身经历过困难挫折才能够牢记于心。
关于绝对定量那点事
绝对定量更麻烦。
需对标准品开展梯度稀释操作, 且至少得有5个点。有时标准曲线呈现出的线性关系极为良好, 然而实际样品经测定后所得到的偏差极大, 这是为何呢? 原因在于标准品与实际样本二者的扩增效率存在差异。
标准品, 它是经过纯化处理的质粒或者PCR产物, 不存在样本里头的抑制物。所以, 凭借标准曲线计算出来的绝对拷贝数，仅仅只能算作是半定量。
当下着手进行绝对定量时, 数字PCR被我用以开展验证工作。将这两者予以结合, 如此数据才能够有底气拿出对外讲述。
最后说几句
荧光定量PCR是个好技术，但它不是万能的。
它要求你具备充足的耐性以及细心特质, 它不会因你按下运行键便自动给出毫无瑕疵的数据, 你得与它磨合, 得知晓它的脾性。
我曾目睹有人借助荧光定量PCR得出了极为完美的曲线, 然而最终却发觉那是受到了污染所致。我还曾见到有人所呈现的数据乍一看显得杂乱无章, 不过经过细致的排查之后才发现原来是RNA降解造成的, 在重新进行提取操作之后, 数据变得美妙得简直能让人感动到落泪。
这项技术所具备的魅力之处在于, 它迫使着你必须严谨起来。倘若做不好, 数据可不会对你有所欺瞒。要是做好了, 它会给予你最为真实的答案。
所以回到最开始的问题，荧光定量PCR准不准？
准，也不准。
看你怎么用。
