我盯着那个扩增曲线，看了整整五分钟。
S形曲线于屏幕之上, 其平滑程度仿若教科书之中的插图。Ct值为27.3, 清晰明了地静卧于彼处。
但我就是不敢写报告。
你清楚不, 荧光定量PCR此物, 看上去高端大气上档次, 仪器不停地嗡嗡作响, 试剂是一管接着一管去添加, 最终得出一连串数字以及一条条曲线。可是真正从事这一行业的人都明白——它并非那般神奇。
不是它不科学，是它太科学了。
科学到每一个环节都能出错，每一步都可能让你翻车。
荧光PCR检测到底靠不靠谱
靠，也不靠。
这话说得跟没说一样？那你听我解释。
绝无问题的荧光PCR原理本身, 确实没任何问题, 它依靠特异性扩增, 且会对荧光信号做实时监测, 此项技术可是获得过诺贝尔奖的, 然而关键在于, 进行操作的主体是人。
我见识到了极为离谱的事情, 有那么一个人, 把样本加到了错误的孔里, 是那种96孔的板子, 居然整排都加错了, 偏了一列。那之后出现了什么样的结果呢? 原本呈阳性的变成了阴性, 而原本呈阴性的变成了阳性。
仪器不知道这些。
仪器只会忠实地说：这个孔有荧光，那个孔没有。
你说，这能怪PCR不靠谱吗？
为什么你的Ct值忽高忽低
很多人问我这个问题。
我说，你先别管Ct值，你先想想你的样本是怎么处理的。
样本处理，这玩意儿才是荧光PCR检测里最大的坑。
核酸提取的这一步骤, 简直堪称是万恶的源头。要是你提取的效率比较低, 那么Ct值就会比较高；要是提取效率高, 那Ct值相应的就会低。然而对你而言, 每次提取的效率能够呈现出一样的情况吗? 那是根本不可能的。
还有抑制物。
我存在一位友人, 进行了为期半年的荧光PCR操作, 其数据始终处于不稳定的状态。随后得以发觉, 乃是他所使用的那个提取试剂盒出现了问题, 该试剂盒里面的某一种成分会对后续的PCR反应产生抑制作用。
换了之后，一切正常。
半年啊，半年的数据全废了。
荧光定量PCR和普通PCR差在哪
这个问题太基础了，但我发现很多人真的搞不清楚。
普通PCR, 是要进行跑胶操作的, 然后看看条带情况, 存在条带即表示有, 不存在条带就表明没有, 以此来进行定性判断。
荧光定量PCR不一样。
它能够告知你具体的数量情况, 进行实时的监测工作, 在每个循环过程当中都对荧光强度予以记录, 最终计算得出一个Ct值, 这个Ct值与初始模板量呈现出反比的关系, 也就是说模板数量越多, Ct值就越小。
但这意味着什么？
表明你能够去开展许多先前没办法做到的事情, 举例而言, 对基因表达量的改变进行检测 , 举例来说，剖析病毒的载量。
前提是，你做得对。
操作荧光PCR最容易翻车的地方
我觉得是加样。
别笑，真的。
那个96孔板, 每一个孔要添加多少微升的物件。手稍微抖那么一下, 就没了。或者情况更糟糕些哎——东西是加进去了, 然而却产生气泡。
气泡会让荧光信号异常。
另外存在封膜, 封膜倘若封得不好, 就会出现蒸发情况, 还存在孔间被污染现象, 一切状况都有发生的可能性。
每次都要看好几遍。
结果分析时最容易被忽略的事
扩增曲线。
很多人只看Ct值，不看曲线形状。
这是个巨大的错误。
正常的扩增曲线呈现为S形, 其形态平滑, 外观漂亮。然而异常的扩增曲线又是什么样的? 是那种走势陡峭的吗? 还是走势平缓的? 或许是存在双峰情况的? 亦或是有着台阶状的?
每一种异常，背后都有原因。
非特异性扩增或许能够表明双峰情况出现, 仪器问题或者试剂问题有可能致使有台阶现象存在。
你不看曲线，只看数字，就是在赌博。
荧光PCR检测到底能说明什么
Ct值？当然能说明。
但你要结合具体情况。
比如说, 是同一批的样本, 是同一个操作员, 是同一台仪器, 是同一种试剂盒, 只有如此这般, 这时候的Ct值才具备可比性。不然的话, 你将今天的Ct值拿去和上周的作比较, 其意义是不大的。
并且, 阈值该如何进行设定呢? 不同的阈值, Ct值呈现出极大的差异。
某些机器是自动进行设置的, 而另外一些则需要手动操作。那么手动该如何进行设置? 是依照软件给定的默认方式来设置吗? 还是依据阴性对照的情况加以调整?
这里面的门道，够写本书了。
新手最常犯的错误
太相信结果。
真的，太相信了。
拿到结果，不质疑，不复查，直接发报告。
于实验室之中, 我已然见识到数目众多这般的实例, 即某一个样本呈阳性状况, 随后进行一次复查, 结果显示为阴性。缘由究竟何在呢? 其一, 有可能是首次开展操作之时发生了污染情况；其二, 也有可能是试剂方面存在着问题；其三, 或许是仪器发生了波动所导致的。
凡是重要结果，一定要复查。
这不是不信任荧光PCR，这是对自己的工作负责。
荧光PCR的未来会怎样
会越来越自动化，越来越智能化。
但现在，它还是个需要人用心去操作的玩意儿。
如同驾驶汽车一样, 即便自动驾驶技术已然十分先进，可你绝不能够完整彻底地放开双手, 究其原因在于总是会存在意外状况, 总是会有系统无法识别分辨的事物。
荧光PCR也一样。
日渐高级起来的仪器, 越发趋于稳定的试剂, 然而, 身为操作者的经验以及判断, 始终都是那占据最终位置的一道防线。
有一台荧光PCR仪, 它已被使用了五年, 此刻放置在桌上, 我看向它, 其屏幕之上, 正显示着方才那一批样本的结果。
我拿起笔，开始写报告。
Ct值27.3。
复查过一次，结果一致。
可以发了。
