实验室里的灯光总是白得有些刺眼。
盯着显微镜看久了，眼球干涩，心里也发慌。
今天要做个免疫荧光，或者WB，或者是ELISA。
不管哪种，最后都得靠那个小小的瓶子——二抗。
很多人觉得，二抗不就是个配角吗？
一抗都定好了，二抗随便买一个能结合的就行。
大错特错。
真的，大错特错。
我就见过新手因为二抗选错，跑出来的图比鬼画符还难看。
信号弱得像蚊子叫，背景黑得像深夜的胡同。
那时候你再去哭，去骂供应商，都晚了。
实验做废了，样品没了，时间没了。
这才是最让人绝望的。
所以，咱们今天不聊那些高大上的分子式。
就聊聊怎么在茫茫多的二抗里，挑出那个“对的人”。
二抗怎么选才不踩坑？
你得看你的一抗是谁家的。
这是铁律。
一抗是小鼠产生的，二抗就必须是抗小鼠IgG的。
一抗是兔子的，二抗就得扛兔子。
这点常识，谁都知道。
但麻烦的是，很多一抗是多克隆的，有的是单克隆的。
如果是多克隆，里面可能混杂着IgG、IgM，还有轻链重链。
这时候，你的二抗就得“雨露均沾”。
通常我们会选针对全IgG的二抗。
但如果你的一抗是单克隆，而且你特别在意特异性。
那你可能只需要针对重链的二抗，或者针对特定亚型的。
比如小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3。
这四个亚型，结构上有点小区别。
如果你的二抗只认IgG1，而你的一抗其实是IgG2a。
那你忙活一天，最后屏幕上一片空白。
那种心情，就像表白被拒，还是被当场拉黑。
所以，看清一抗的亚型，再匹配二抗的靶向性。
这一步，不能省。
种属交叉吸附到底有没有用？
这是个老生常谈的问题。
很多二抗说明书上写着：“经过交叉吸附处理”。
听起来很高大上，对吧？
意思是，这个二抗不会乱认人，只认它该认的那个物种。
比如，你要用兔二抗去染小鼠的组织。
但你的样本里，可能有内源性的兔蛋白吗？
或者，你的细胞系本身表达一些非特异性的蛋白？
若不实施交叉吸附, 二抗便有可能与这般杂乱无章的事物相互结合在一起。
结果就是——背景脏。
背景一脏，信号再强也看不清楚。
好似你于沸反盈天的酒吧之内听他人言语, 哪怕那一方把嗓子喊至嘶哑破碎, 你亦没能够听清。
所以，对于组织切片，尤其是复杂组织的免疫组化。
强烈建议选用经过交叉吸附的二抗。
虽然贵一点，但那是真金白银换来的清晰度。
值得。
但是，如果是简单的细胞Western Blot。
背景通常没那么复杂。
你可以稍微省一点钱，选没吸附的。
当然，如果你不差钱，或者追求极致的干净。
那就全上吸附的。
毕竟，数据漂亮，老板才高兴。
老板高兴，你才有奖金拿。
这才是硬道理。
荧光二抗还是酶标二抗？
这取决于你的下游检测手段。
倘若你所进行的是免疫荧光, 也就是IF, 或者是免疫组化荧光, 即IHC - F。
那必须选荧光标记的二抗。
时常能见到的存在着Alexa Fluor系列, Cy系列, FITC, TRITC等等。
这里有个坑，要注意。
不同荧光染料的亮度、光稳定性不一样。
488 和 555 的 Alexa Fluor, 一般来讲相较于 FITC 以及 TRITC 更为明亮, 并且也更具备耐光性。
如果你用的激光共聚焦，通道很多。
那就要注意光谱重叠的问题。
别让你的红色信号串到了绿色通道里。
那样数据就废了。
倘若你所进行的是Western Blot, 又或者是普通的显色免疫组化。
那选酶标二抗。
HRP（辣根过氧化物酶）是最常用的。
效率高，信号放大倍数好。
但HRP也有缺点，怕过氧化氢，怕高温。
保存的时候，一定要放冰箱。
别嫌麻烦。
一旦酶失活了，你重新配胶、转膜、封闭，那才是真的想死。
还有一种选择，是生物素-亲和素系统。
这个灵敏度更高，适合检测低丰度的蛋白。
但步骤繁琐，背景也容易高。
除非你有特殊的需要，否则一般情况，直接用HRP二抗就够了。
简单，粗暴，有效。
二抗的稀释比例是多少？
这是最玄学的一个问题。
使用说明书的时候, 一般会给出一个推荐的范围区间, 举例来说, 这个范围是从1:1000开始, 一直到1:5000。
但你知道吗？
这个范围，只是参考。
实际工作中，你需要自己摸索。
为什么？
因为你的抗体浓度不同，你的膜质量不同，你的曝光时间不同。
甚至，当天的室温不同，结果都可能不一样。
有的人喜欢高浓度，信号强，但背景也黑。
有的人喜欢低浓度，背景干净，但信号弱得像幻觉。
我的建议是，做个梯度稀释。
左边孔1:1000，中间1:2000，右边1:5000。
跑一次胶，或者染一次片。
看看哪个平衡点最好。
信号清晰，背景干净，那就是你的最佳比例。
一旦确定了，就把它记下来。
写成实验记录。
下次再做同样的实验，直接用这个比例。
能省掉很多无谓的试错成本。
别偷懒。
实验记录的每一行字，都是你以后救命的稻草。
保存二抗要注意什么？
二抗，特别是荧光二抗，很娇气。
怕光，怕热，怕反复冻融。
每次用完，马上放回-20度冰箱。
别放在4度冰箱里过夜。
4度只是临时存放。
长期的，必须是-20度。
而且，最好分装。
买回来一大瓶，自己分成小管。
每次只用一管。
别反复冻融。
反复冻融会让抗体变性，活性下降。
到时候，你花高价买的二抗，变成了“废液”。
心疼吗？
心疼就对了。
所以，勤快点。
分装，标记好日期。
过期的二抗，坚决不用。
别指望它能给你惊喜，它只会给你惊吓。
其实，选二抗没那么复杂。
核心就三点：
匹配一抗的种属和亚型。
根据实验目的选标记物（荧光还是酶）。
做好预实验，找到最佳稀释比例。
其他的，都是锦上添花。
实验室的生活，就是由无数个这样的细节组成的。
有时候，一个小小的二抗选错了，导致整个项目延期。
有时候，一个小小的二抗选对了，让你提前下班回家睡觉。
这种掌控感，是实验中最迷人的部分。
希望这篇笔记，能帮你避开那些坑。
让你的下一次实验，信号满格，背景洁白。
像清晨的天空一样纯净。
好了，我要去洗烧杯了。
你也加油。
