PCR电泳原理:
PCR电泳主要是琼脂糖凝胶电泳。电泳仪有正负极的,而DNA是带负电荷的。故而向正方向移动。然后DNA里是有碱基的。碱基可以吸收紫外光。最重要的是有染色剂,常用的有溴化乙锭等等。一般在配制凝胶的时候会加进去,或者跑完电泳然后将凝胶浸在含有染色剂的溶液里,染色剂可以插入DNA链中。在可见光下是看不见条带的,但在紫外光照射下就能出现条带。
PCR扩增后一般进行琼脂糖凝胶电泳分析,电泳后一般有以下几种条带:
1、引物带。引物浓度过高或是扩增效率不是特别高时都会有,一般不呈现为细带,为发散状;如果目的扩增产物带和引物带都很亮,可以考虑适当降低引物量。
2、引物二聚体带。比引物跑得慢一点,条带清晰,但如果扩增产物小于100bp时,产物与引物二聚体就不好分别了,建议采用DNA聚丙烯酰胺电泳(不是蛋白质的SDS聚丙烯酰胺电泳);如果引物二聚体在优化复性温度后仍然严重影响目的产物的扩增,优先考虑更换引物设计(因为引物合成的成本比反复优化条件的成本低)
3、目的扩增产物带。其大小与设计大小相同,条带清晰。
4、非特异扩增产物带。其大小与设计大小不相同,条带清晰。一般考虑通过提高复性温度来减少或消除(也可用温度梯度功能来寻找zui佳的复性温度,东胜龙811型PCR仪就有此功能)。如果其片段大小比目的片段大较多,可以通过减少延伸时间来减少或消除(即不给它足够的延伸时间)。还有一种非特异扩增产物带是来自于逆转录PCR实验时的基因组DNA的污染,如果目的扩增产物中有内含子,扩增产物很可能大于目的基因。这种条带通过优化复性温度是不能消除的,可以在逆转录前用无RNA酶的DNA酶进行样本处理。
5、模板DNA带。模板浓度过高时可能出现。如果是基因组DNA为模板,条带可能会很乱且较大。一般进行PCR扩增时,模板浓度都不要太大,否则会产生一些比目的基因长一点的杂质DNA(可能不成条带,也看不到),这是由PCR扩增原理造成的。
PCR电泳是一种常用的分子生物学技术,结合了聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳来鉴定和验证目标DNA片段的存在。这一技术的流程包括以下几个步骤:
1. DNA提取:从样品中提取基因组DNA,通常使用特定的试剂盒,如TIANamp Genomic DNA Kit,确保DNA的纯度和完整性。
2. PCR扩增:根据目标序列设计特异性引物,通过三步法程序(预变性、变性、退火)进行PCR扩增,扩增特定的DNA区域。扩增条件包括98℃预变性10秒,55℃变性5秒,72℃退火5秒,循环40次。
3. 电泳分析:将PCR产物与DNA Marker混合后,通过琼脂糖凝胶电泳分离。DNA Marker用于指示DNA片段的大小,帮助判断扩增产物是否符合预期。电泳时,带负电的DNA分子向正极移动,根据迁移速度不同形成条带。
4. 染色与观察:电泳后的凝胶用核酸染料(如GelRed)染色,使DNA条带显色,便于观察和分析。
5. 结果解读:通过与Marker对照,可以定性或定量检测样品中目标核酸的存在,验证基因分型、克隆验证、突变检测或病原体核酸筛查等。
技术优势包括高特异性、快速直观、以及对不同样本类型的适应性。然而,在实际操作中可能会遇到多种问题,如非特异性扩增、条带模糊、产物降解、无条带或引物二聚体等,需要通过优化引物设计、调整退火温度、控制模板量和酶用量、以及确保电泳条件正确来解决。