在荧光定量PCR（qPCR）中，SYBR Green I染料作为一种嵌合荧光染料，用于实时监测DNA双链的形成。它的工作原理基于其对双链DNA（dsDNA）的特异性结合能力。SYBR Green I 是一种广泛应用于荧光定量PCR（qPCR）中的荧光染料，其作用机制核心在于非特异性结合双链DNA（dsDNA），实现实时监测和定量核酸扩增过程。
一、SYBR Green染料的发挥作用原理
1、实时监测PCR扩增：在qPCR循环中，随着变性、退火和延伸步骤的进行：
Ø 退火阶段：引物与模板结合形成部分双链，少量染料嵌入其中，荧光信号初步上升。
Ø 延伸阶段：新合成的dsDNA产物累积，更多染料结合，荧光信号持续增强。
Ø 每个循环结束时测量荧光信号，通过绘制扩增曲线，实时反映DNA扩增量。
2、荧光增强机制：SYBR Green I 在游离状态下荧光信号微弱，但当其嵌入dsDNA的双螺旋小沟区域后，荧光强度急剧增强800至1000倍。这种结合导致染料分子发光显著增加，信号强度直接与dsDNA的量成正比。
3、定量分析基础：初始模板DNA的浓度通过比较荧光信号与标准曲线计算得出，SYBR Green的高灵敏度（可检测pg级dsDNA）确保了对低丰度目标的精准定量。
4、特异性结合双链DNA：SYBR Green是一种非特异性染料，通过静电作用嵌入双链DNA（dsDNA）的小沟中形成稳定复合物。其分子结构含正电荷基团，与DNA磷酸骨架结合，芳环结构插入碱基对间，游离状态下荧光微弱（量子产率低），但与dsDNA结合后构象舒展，荧光强度急剧增强800-1000倍。
二、SYBR Green染料的应用优缺点
优点：
通用性强：无需设计探针，适用于任意物种和模板类型（如cDNA、病毒DNA）；
灵敏度高：可检测pg级dsDNA，成本低且操作简便；
操作便捷：直接加入PCR反应体系，简化实验流程且成本较低。
兼容性优良：激发波长（497 nm）和发射波长（520 nm）适配主流qPCR仪器，稳定性高（DMSO剂型可长期保存）。
缺点：
非特异性结合：可能结合引物二聚体或非目标产物，导致假阳性；
需熔解曲线验证：通过分析产物熔解温度（单一峰值判断特异性）排除干扰。
SYBR Green I染料的使用简化了实验流程，因为它不需要设计和合成特异性的荧光探针，降低了成本。然而，由于它对所有dsDNA均有结合能力，这也可能导致非特异性产物（如引物二聚体）的检测，影响实验结果的准确性。因此，在使用SYBR Green I进行qPCR时，必须通过熔解曲线分析来验证扩增产物的特异性。
