PCR检测法是一种广泛用于检测细胞培养中支原体污染的方法，其具体步骤如下：
一、实验准备
准备培养48小时以上的细胞培养上清液、预混反应液（Mix）、阴性对照（无酶水）和阳性对照（支原体DNA）。
在生物安全柜中操作，对桌面和手部进行消毒。
二、操作步骤
1、样品收集
收集待测细胞的培养上清液，可直接使用或先进行细胞裂解以释放DNA。
2、DNA模板制备
对于细胞上清液，直接取适量用于PCR。
对于细胞悬液，需先进行DNA提取。常用方法包括酚/氯仿抽提、乙醇沉淀或其他DNA纯化试剂盒。
3、PCR反应体系配置
根据PCR试剂盒说明书，准备反应混合液，通常包括引物、dNTPs、缓冲液、Taq DNA聚合酶、模板DNA等。
反应体系中可能还需加入阳性对照、阴性对照和内对照。
4、PCR扩增
将反应混合液加入PCR管中，盖紧盖子，防止污染。
在PCR仪上设置扩增程序，通常包括变性、退火和延伸三个阶段，循环多次。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，以观察扩增产物。
5、结果分析
通过凝胶成像系统观察电泳结果，寻找特定大小的DNA条带。
阳性结果通常表现为在特定位置出现明亮的条带，与阳性对照条带位置一致。
有时需要通过比较Ct值进行定量分析。
三、关键注意事项：
1、防污染措施：
实验分区操作（样本处理、PCR配制、扩增区分开）；
使用带滤芯枪头，操作台紫外消毒30分钟。
2、对照设置：
阳性对照：已知支原体DNA；
阴性对照：无菌水代替模板；
内参对照：确保DNA提取有效（如宿主基因）。
3、假阳性处理：
若条带微弱，建议结合荧光染色法或qPCR复检。
通过上述步骤，PCR检测法能够快速、准确地检测细胞培养中的支原体污染，是实验室中常用的检测手段之一。
