夹心法ELISA（双抗体夹心法）是一种常用的检测大分子抗原的免疫分析方法，其核心步骤包括包被、封闭、加样孵育、洗涤、加酶标抗体、显色检测等环节。以下是详细的实验步骤：
一、实验前准备
将试剂盒置于室温平衡20分钟，按说明书核对组份完整性。
配制洗涤液：将浓缩洗涤液（如25X）用蒸馏水稀释至工作浓度，混匀备用。
二、标准品与样本处理
标准品稀释：将标准品原液用样品稀释液进行倍比稀释，通常设置S7-S0共8个浓度梯度，S0为空白孔。
样本处理：待测样本需离心取上清，必要时进行稀释。
三、加样与孵育
1、包被：将包被抗体加入酶标板孔中，2-8℃孵育过夜，洗涤去除未结合抗体。
2、封闭：加入封闭液（如BSA），37℃孵育1-2小时，阻断非特异性结合位点。
3、加标准品/样本：每孔加入100μL标准品或待测样本，37℃孵育90分钟。
4、加生物素化抗体：加入生物素标记的二抗，37℃孵育60分钟。
5、加酶结合物：加入HRP标记的链霉亲和素，37℃孵育30分钟。
四、洗涤与显色
每次孵育后，用洗涤液洗板3-5次，拍干液体。
加入底物（如TMB），37℃避光孵育15-30分钟，显色后加入终止液终止反应。
五、检测与数据分析
用酶标仪在450nm波长读取吸光度值（OD值）。
绘制标准曲线，通过OD值计算待测样本浓度
六、注意事项
1、加样时需更换枪头，避免交叉污染。
2、孵育时间、温度需严格控制，覆膜减少蒸发误差。
3、显色后需立即终止并检测，避免过度反应。
以上步骤综合了常规双抗体夹心法的流程，具体操作可能因试剂盒类型略有差异。
