ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种广泛用于临床诊断和科研的高通量检测技术，其灵敏度决定了能否准确检出低浓度的目标分子（如生物标志物、病毒抗原等）。高灵敏度对于早期疾病发现、微量药物监测和痕量污染物分析至关重要。影响灵敏度的因素众多，需系统性优化各个环节。
提高ELISA检测灵敏度的主要方法
提高ELISA检测灵敏度的核心优化策略，可分为三大类：抗体相关优化、信号放大与检测改进、实验操作精细化。
1.抗体性能优化（提升结合能力）
选用高亲和力抗体：使用单克隆抗体（特异性高）或多克隆抗体（结合能力强），优先选择经ELISA验证的产品。
优化抗体配对：在夹心法中，确保捕获抗体与检测抗体识别目标物的不同表位，避免空间位阻。
合理滴定抗体浓度：通过棋盘格试验确定最佳包被抗体（通常0.1–1 μg/mL）和检测抗体浓度，过高会导致非特异性结合，过低则降低捕获效率。
2.信号放大与检测系统升级（增强可读信号）
采用更敏感的底物系统：
化学发光底物（如CSPD）比传统TMB显色灵敏度高100–1000倍。
使用碱性磷酸酶（AP）替代辣根过氧化物酶（HRP），搭配高敏底物可显著提升信号强度。
引入纳米材料增强信号：
金纳米颗粒（AuNPs）或量子点（QDs）标记抗体，利用表面等离子体共振效应增强显色或荧光信号，检测限可降低10倍以上。
3.实验条件与流程优化（减少噪声、提升信噪比）
优化包被条件：选择合适的缓冲液（如pH 9.6碳酸盐缓冲液）、控制孵育时间与温度，以提高抗原/抗体固定效率。
有效封闭非特异性位点：使用5%脱脂奶粉或0.5%–1% BSA作为封闭剂，减少非特异性吸附，降低背景噪音。
加强洗涤步骤：充分清洗未结合成分，避免残留试剂造成背景升高。
延长孵育时间或提高温度：适当延长抗体孵育时间（如2小时代替1小时）或控制在37℃，有助于反应趋于平衡，提升结合效率。
使用高结合力微孔板：选择经特殊处理的聚苯乙烯板（蛋白结合量达300 ng/cm²），提高包被效率。
主要优化方法对比表
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优化方向 |
具体措施 |
灵敏度提升效果 |
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抗体选择 |
使用高亲和力单克隆或多克隆抗体 |
显著提升低浓度检测能力 |
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检测系统 |
改用化学发光底物（如CSPD） |
比TMB显色高100–1000倍 |
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信号放大 |
金纳米颗粒（AuNPs）标记抗体 |
检测限降低约10倍 |
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封闭策略 |
使用BSA或脱脂奶粉封闭 |
有效降低背景噪音 |
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孵育条件 |
延长孵育时间或升至37℃ |
提高抗原抗体结合充分性 |
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微孔板类型 |
使用高结合力酶标板 |
提升包被效率和信号稳定性 |
补充说明:不同ELISA类型也会影响灵敏度，例如夹心法适用于大分子抗原，通常比直接法更敏感。
建议
为最大程度提高ELISA检测灵敏度，应采取“组合拳”策略：
在方法建立初期，优先筛选高亲和力且已验证的抗体对；
采用化学发光或纳米增强型检测试剂盒替代传统比色法；
系统优化包被、封闭、洗涤和孵育条件，并通过预实验确定最佳参数；
必要时使用SPR或BLI技术验证抗体亲和力，确保结果可靠性。
