凭借着高灵敏度这样的特性，以及精准定量的能力，荧光定量PCR技术成为了分子生物学实验室里不能缺少的工具，它通过实时监测荧光信号，以此实现对目标核酸起始模板量的测定，这种测定是准确的，它广泛应用于基因表达分析、病原体检测、转基因成分鉴定等领域。
什么是荧光定量PCR
荧光定量PCR是于传统PCR基础之上，引入荧光标记探针或者染料，依靠该检测荧光标记探针进而透过对每个循环之际在产物之中荧光强度变化予以检测，以此动态监控PCR的扩增过程，此为荧光定量PCR同终点法PCR不一样的地方，不一样之处在于荧光定量PCR于指数扩增期去采集数据，所以也就能够做到定量更为精确，其核心在于Ct值也就是循环阈值同起始模板量呈现出线性关系，凭借标准曲线就能够计算出未知样本的拷贝数。
荧光定量PCR的步骤有哪些
实验开展之前，需要构思设计出具有特异性的引物以及探针，并且借助常规的PCR展开验证工作。反应体系的配制环节，务必要严谨地防止气溶胶出现污染情况，较为建议在超净工作台开展操作。常见的程序涵盖有：预先变性95℃持续5分钟，随后历经40个循环的变性95℃ 15秒、退火延伸60℃ 1分钟，与此同时收集荧光信号。最终进行熔解曲线分析（采用SYBR Green法）或者直接读取Ct值。
如何优化荧光定量PCR实验
具有决定性意义的是引物设计，其GC含量需处于40%至60%之间，长度一般为20到24nt，要防止出现发夹结构以及二聚体。模板质量会对结果产生直接影响，建议采用高纯度RNA并进行去除基因组DNA的处理。退火温度要借助梯度PCR来筛选最佳数值，通常比引物Tm值低3至5℃。加样的时候需使用带滤芯枪头，针对每个样本要设置三个复孔用以评估重复性。
荧光定量PCR常见问题解决
扩增曲线未呈现S型，一般提示着模板量很低，或存在抑制剂残留。非特异性产物，能够借助降低引物浓度，或者提高退火温度来加以改善。要是复孔Ct值的差异大于0.5，那么就需要检查加样精度，或者稀释模板。当没有荧光信号的时候，优先去排查ROX校正染料，跟仪器型号是否匹配。不定期地使用无核酸酶水来做阴性对照，能够有效地识别交叉污染。
