对于蛋白免疫印迹、免疫组化这类生物学实验而言，二抗身为信号放大的关键工具，它的质量会直接致使检测结果受影响。要正确挑选二抗，要正确使用二抗，还要正确保存二抗，以此显著提升实验的重复性以及灵敏度。接下来会从三个实操角度来分享经验。
二抗种属来源怎么选
对于二抗而言，其种属要严格去匹配一抗的宿主来源才行，比如说，要是一抗是源自小鼠的，那二抗就非要去选择抗小鼠的那种二抗不可，除此之外，要留意二抗是不是需要进行预吸附，以此来降低交叉反应，对于多色标记实验来讲，建议去挑选经过交叉吸附处理的二抗，这能够显著地减少非特异性背景。
同一时间需要去考量二抗的标记种类，酶标记，像HRP这种，适宜用于化学发光检测，荧光标记，例如FITC，是用来做荧光成像的，依据下游检测设备去挑选恰当的标记物，防止信号过强或者过弱，要是不确定的话，可以先去查阅同类文献里所使用的二抗信息。
二抗使用时的稀释比例
用于二抗的推荐稀释比常常会被标注在说明书之上，然而具体的数值是需要借助预实验来进行优化的。初始的比例能够按照从1:5000至1:10000这样的范围去进行测试，进而观察信噪比以及背景强度。不同的批次亦或是品牌的二抗活性很可能会存在着差异，每一次更换新的批次都建议重新进行校准。
在实际的操作情形当中，封闭步骤究竟是不是足够彻底这一情况，同样是会对稀释所呈现出来的效果产生影响的。当运用含有脱脂奶粉或者BSA的稀释液来开展工作的时候，一般而言是会比仅仅使用单纯的缓冲液更能够起到降低背景的作用的。要是背景处于偏高的状态，那么可以适当地去提高稀释的倍数或者是缩短孵育所需要的时间。需要留意的是，孵育的温度通常来讲是室温持续1小时或者是在4℃的环境下过夜，后面这种情况信号会更强一些，不过需要对背景加以控制好。
二抗如何正确保存
没有经过稀释的二抗原液，应该按照说明书所要求的那样去存放，一般情况下是在零下二十摄氏度的环境中，进行避光保存。当收到二抗之后，建议把它分装成为小份，每一份仅仅只够单次使用的量，防止因为反复冻融从而致使活性降低。荧光标记的二抗特别害怕光，需要使用铝箔对其进行包裹。
不建议长期保存稀释过后的二抗，最好是现用现配。要是必须短期留存，那么可以在4℃避光放置，放置时间不超过24小时，不过再次使用的时候信号强度有可能衰减。另外，添加叠氮钠当作防腐剂会抑制HRP活性，所以HRP标记的二抗稀液里面不可以添加。每次取用的话要使用无菌枪头，以此防止污染。
