免疫组化抗体是什么原理
免疫组化技术借助了抗体与抗原二者出现特异性结合的特性，借由显色反应在组织里定位要找的蛋白，或者在细胞里定位要找的蛋白。抗体身为“探针”，能够精准识别靶点所处位置以及表达水平。其原理是建立于抗原和抗体的反应以及酶拥有的催化引起显色的基础之上的，通常是用标记二抗的方式，标记二抗常用辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶，加入底物之后会产生颜色沉淀，在显微镜下面从而能够清晰地进行观察。理解这一原理是成功应用的基础。
如何挑选合适的抗体克隆
单克隆抗体是针对单一表位的，其特异性很强，批次稳定，适宜检测结构变异小的靶点；多克隆抗体可识别多个表位，信号更强，耐受抗原修饰，适合低表达或降解的样本。挑选时要先确认目标蛋白的种属同源性，去查阅文献里已验证的抗体克隆号。对于磷酸化位点，优先选择单克隆。同时要考虑实验目的，定性定位需要用单抗进行，丰度检测可以采用多抗。
一抗稀释比例怎样优化
不存在通用的稀释比例，得经由预实验去摸索，起始要参照抗体说明书所推荐的范围，像1比100至1比2000那样，选取阳性对照组织来进行梯度稀释，分别为1:50、1:100、1:200、1:400这些比例，同时设置阴性对照项目，最佳的稀释度依据背景清晰、阳性信号强烈并且不存在非特异染色的标准来确定，样本固定的时间越长久，抗原掩蔽的情况也就越严重，通常需要提高浓度或者延长修复时间，每一次更换新的批次抗体都应当重新进行滴定。
抗原修复方法怎么选
甲醛水固定以及石蜡包埋会使抗原表位发生交联，就此必须要进行修复。热诱导修复常常会使用微波炉、高压锅或者水浴，缓冲液可选择柠檬酸盐（pH6.0）或者Tris - EDTA（pH9.0）。酶修复会用到胰蛋白酶或者胃蛋白酶，其适合于膜蛋白。应当优先尝试热修复，因为对多数靶点是有效的。要是信号微弱，就要改用pH值高的缓冲液；一旦背景过高那就降低pH值或者缩短加热时间。冰冻切片不需要进行修复，但对于长期保存的样本建议去做预实验来判断。
怎样判断染色结果可靠性
每个批次的实验，都一定要设置阳性对照，也就是已知会表达的组织，还要设置阴性对照，即同型抗体或者省略一抗。阳性信号，应该定位在预期的亚细胞区室，像核、膜或浆那里，而且其强度得是均一的。非特异染色表现出来的样子是弥漫背景或者在错误区域着色。要是对照不符合标准，那全批的结果就都作废了。边缘效应常常是因为样本干燥导致的，内源性过氧化物酶要用3%过氧化氢去阻断。建议同时对内参蛋白进行检测，以此来验证样本的完整性。
