免疫组化在蛋白定位里头扮演核心角色，于表达分析方面也是如此，不管是基础科研，还是生物技术应用，都少不了它。正确去选择抗体，正确来使用抗体，这直接就决定了实验结果的可靠性，决定了实验结果的可重复性。下面依据实际经验，梳理出几个最常碰到的要点。
如何挑选合适的免疫组化抗体
面对着成百上千种产品，首先得去确认抗体是不是经过了组织样本验证，去查看说明书里的“应用”栏，明确标注了IHC - P（石蜡切片）或者IHC - Fr（冰冻切片）才是适合于你的实验类型。其次要去关注克隆性，单克隆抗体特异性很强，适合用来检测单一表位；多克隆抗体灵敏度很高，能够识别抗原的多个位点。最后可千万别忽略物种反应性，要确保抗体跟你的样本来源相匹配，比如说小鼠组织就得选抗小鼠的抗体。
免疫组化抗体验证方法有哪些
就验证抗体而言，并非所拿到的货物直接就拿来使用。最为可靠的方式乃是设置阳性以及阴性对照，其中阳性对照采用已知表达该蛋白的组织切片，而阴性对照要用同型对照抗体或者封闭一抗。除此之外，借助WB也就是蛋白印迹预先确认目标条带大小，能够将抗体交叉反应的风险给排除掉。还能够尝试抗原修复条件的优化，像是对比柠檬酸缓冲液与Tris - EDTA的染色效果，从而找到最适配你样本的预处理方案。
抗体稀释比例怎么确定
不存在通用的稀释比例，得自己去进行梯度测试，建议先去查阅产品说明书所推荐的起始比例，像1:100这样，接着做1:50、1:200、1:400这三组对比，稀释液也是非常关键的，用含有BSA或者羊血清的缓冲液去替代纯PBS，能够减少背景非特异性着色，孵育时间得保持恒定，4℃过夜一般比室温1小时染色更加均一，每次实验都要记录最佳比例以及对应的组织类型，以此形成属于你自己的参考数据库。
非特异性染色如何避免
常常令人头疼的非特异性染色，多数是由于封闭不足或者抗体浓度太高所致。换用和二抗同源的正常血清来封闭30分钟，比如羊血清，其效果要比BSA更好。洗涤也必须到位：每次洗涤得用PBST也就是含吐温的PBS浸泡5分钟，重复三次。要是背景依旧明显，那就试试在抗体稀释液之中加入0.1% Triton X-100，或者更换二抗的品牌。另外，内源性过氧化物酶用3%过氧化氢预处理10分钟便能够消除。
你是否曾历经因抗体选取不恰当进而致使重复开展实验的过往呢，热忱欢迎于评论区域分享你那关于优化的心得体会哟。
