最近老是在刷到一个词。
什么是一抗？
确切来讲，是在实验之中，与你所关注的目标蛋白展开“较真”行为的那个存在。此前，我还特意进行了一番查询，，原来第一抗体，乃是能够和特定抗原实现特异结合的那一类免疫球蛋白。然而，仅仅知晓其定义又有什么实际的用处可谈，我可是被它折腾得极为够呛的。
怎么选才不会踩坑？
谈及此事满心都是泪，当初刚开始入门的那个时候购买抗体，仅仅只是一味地盯着价格去瞧，哪一个价格低廉便选择购买哪一个。那么最终的结果又是怎样的呢？
WB跑出来背景一片乌黑，杂带比我家的毛线球还乱。
其实选一抗核心就三条：靶点特异性，种属匹配，实验类型。
说明书表明，从事WB工作的方可进行WB操作不是，否则宛如赌博。另外亦存在单抗跟多抗的差异之处呢，其一具备专一性，另一则拥有灵敏性。然而当时又何尝有人能够理解呀，于是便胡乱购买一番了。
一抗稀释浓度多少才合适？
这个我最头大。
早先于论坛之中瞧大神们议论，浓度要是太过稀薄信号微弱到瞧不见，浓度要是过于浓稠背景模糊成一团。有人采用 1:500 的比例，有人运用 1:2000 的比例，看得我完全陷入迷茫状态。
那会儿学机灵了，弄几个不同的梯度去跑一跑，不就能知晓了嘛，像一百比一、一比一千、一比两千这些比率都去尝试一番。看看谁发在朋友圈里展现出来的效果更为出色，那就采用谁的。
不过，不能够一味地执着于一抗，二抗也务必得跟着进行调整，首先确定一抗的浓度，随后再对二抗加以调整，按照一定的次序逐步推进。
非特异性条带是怎么回事？
反反复复跑条带，每次我都觉得——完了，这次肯定又翻。
有着高背景、存在多条带，其原因各种各样。一抗若是因浓度过高而出现问题，还有一抗因非特异结合而出现问题。
此前有那么一阵子，即便是内参这一块儿我都跑不出来结果，经过一番查验，最终得以发现原来是一抗已然过期了这种情况——那可是过期长达好几个月的，并且还经历了反复的冻融这般状况。自那之后我便予以留意了，将其进行分装好之后放置于零下二十度的环境中，使用多少就解冻多少，杜绝反复冷冻这种行为。
没错，有时候出现的所谓“非特异条带”，实际上说不定压根就并非是非特异的情况。去查询一下蛋白数据库，有可能是由于翻译后修饰、蛋白亚型或者剪切体所引发的。我遭受过这个情况带来的困扰起码三次了。
一抗保存有哪些注意事项？
跟我一样，喜欢把抗体全放4度的举个手。
请别再傻了，做实验的前辈所讲的是正确的，液体抗体直接放置于零下八十摄氏度的环境中，能够保存五六年之久，加入百分之五十的甘油后放置于零下二十摄氏度，保持三四年是没有任何问题的，要是经常使用，将其分成一小管放置于四摄氏度的环境下，能够支撑半年。
最怕的就是反复地冻融，每融化一回，抗体活性的百分比便会急剧地暴跌一回。要进行分装操作才是确保安全无虞的秘诀所在，千万别嫌这样做会麻烦而不去做。
此外，尽量别选用无霜冰箱。其在自动除霜之际，温度会一会儿高一会儿低，相较于你自行进行冻融而言，对抗体造成的损害更大。
上次听闻有人将一抗当作二抗使用了，颜色标签并未贴错，只是没看清瓶身上所写的字，这次实验直接宣告报废，内心真的好想把自己的脑子抽出来进行清洗一番。
关于保存这个事情，在后来我养成了习惯，当拿到一支新的抗体时，马上进行分装操作，十支小的管子摆成一排罗列着，同时标注上日期、名称以及浓度。不管是哪一天用完了，当天就能够清楚知道，这一管是几月份开启使用的，相较于之前心里踏实了许多。
一抗和二抗有什么区别？
这个我刚学时的困惑。
直接抓取抗原的是一抗，抓取一抗的是二抗。一抗源自小鼠，二抗就应为抗小鼠的，像山羊抗小鼠之类的。倘若种属选错，那便连影子都无法见到。
留意清晰区分，一抗的种属状况决定了你所需要采用什么来辨识它，不要将来源种属以及识别特异性弄混淆了。
用来检测的一抗需不需要进行标记呢？通常情况下是不需要的。间接法具备信号放大的优势，一个一抗能够结合多个二抗，信号会快速地往上升。所以不要想着贪图省事去购买标记一抗，能够直接用于化学发光检测的并不便宜，并且适用的范围还比较狭窄。
在进行标记之前的抗体，一般情况下还需要进行抗原修复，否则要是表位被交叉固定给遮盖住了。在跑免疫组化的时候，我老是会忘记。
某些时候，我更倾向于选用标签抗体，像His-tag或者Flag-tag这类的，直接去辨认融合蛋白上面的那个小标签，进而省去诸多验证特异性所带来的麻烦。
一抗为什么那么贵？
这是我一开始最心痛的。
一瓶抗体，价值几千块，其体积仅仅只有那么一两百微升。后来知晓，研发所需成本高昂，特别是单克隆抗体，在细胞系筛选这一环节，需要进行验证，之后还要进行纯化，无论哪一步骤，都要耗费大量资金。
但是，价格昂贵自有其昂贵的缘由所在。那些价格便宜的仿冒抗体，所跑出的图案简直根本没法看——其背景脏污到了让人不忍心直接去看的程度。而拥有验证数据的抗体，即便多花费一些金钱，却能省下重新做实验的时间，这是值得的。
对于国产品牌而言，性价比着实具备竞争力。日常筛选工作选用国产产品，然而在关键数据验证方面则采用进口产品——不管怎样，到最后撰写文章之际，抗体的品牌相关信息是必须罗列上去的，因为审稿人只需一眼便能清晰探知你所使用的是哪一家的产品。
并且抗体偶尔会出现停产的情况，特别是小众的靶点，我如今都会多储备几支不属于同一批次的，又或者准备一个克隆号存在差异的备用的，防止等到实验进行到一半的时候发觉买不到了，那样可就真是叫处于十分无奈且悲哀的境地了。
WB信号太弱怎么办？
翻车次数多了，也算攒了点经验。
信号呈现出较弱的态势，首先会想到的便是一抗的浓度不足。略微将其调高一些，又或者把孵育的时间予以延长，然而却存在着背景变高这样的风险。
同时进行一下蛋白提取情况的排查，排查内容包括，蛋白提取是否出现了降解现象，上样量是否过少，转膜是否失败了呢？
除此之外，还有样本处理方面的细节情况。曾有一回 ，我着手进行磷酸化蛋白的相关操作 ，然而最终却怎么都无法跑出条带。直至后来才发觉 ，原来是忘记添加磷酸酶抑制剂了 ，以至于蛋白在提取的进程当中发生了脱磷酸化现象。仅仅是如此这般一个细微的环节 ，便致使整周的工作付诸东流。
若是背景高，有可能是封闭液没选对，是选择 BSA 呢，还是选择脱脂牛奶呢，这要看蛋白类型，要是做磷酸化蛋白，那就别用脱脂牛奶。
有关于洗涤缓冲液之中吐温的含量，这也是相当关键的。要是吐温含量低了，那么就无法将其洗干净。要是吐温含量高了，信号则会被消除殆尽。我通常会使用0.1%的吐温20，并且会依据实际需求进行细微调整。另外，设置那种不加一抗而只加二抗的阴性对照，能够协助你明晰问题究竟出在哪个步骤上。
写在最后
其实这么久下来，觉得一抗就是个磨人的小妖精。
你晓得怎样挑选、采用、存贮它，它便能够乖乖地给予你良好结果；你略微偷一下懒、走一下神，它马上会从你的心底里拉扯出巨大的挫败感。
每次，跑去打开冰箱，拿取抗体之时，对着那一排小小的管子，回想起往昔 consumed 的那些青春时光。
眼睁睁瞧着他人文献里头的图，那一条条宽带清晰得仿若经过了专业图像处理软件精心处理一般。可一旦轮到自身，每一条看似干净的条带背后，实则都经历了最少三次的全盘推翻后重新来了一次。先是进行一次专门的凝胶电泳操作，接着是一次膜转移处理，而后是一次抗体孵育过程，最后是一次曝光程序——就这样四天的时间悄然流逝了，仅仅是为了能够清晰地看清那一条线。
可有那么一瞬间，你那抗体也曾令你萌生出想狠狠摔砸物品的冲动？就好比你所使用的一抗采用的是ABC这种方式，而其他人选用的是Def这种方式，最终显示出来的条带全然不一样吗！
近日，网络上疯狂流传着利用AI去预测抗体与抗原结合的构象，以此来辅助设计抗体，我便进行了思考，待这些技术切实普及之后，是否我们就无需再如当下这般，一步步进行尝试，从而弄得如此纠结呢？
想多了。还是先把冰箱里那支兔源的GAPDH找出来吧。
