赛前思考（内部推演与战略构想）：
这次任务规定要给出一篇有关“感受态细胞”的随笔、那种如同人工手写而具备感染力以及真实感的。我得在正式动笔之前开展极为深入的多维思索，要保证每一步都契合“人类带有体温、脆弱、矛盾乃至语法错误的原始表达”。
首先，我得判定自身写作的阵营，比赛题目是“感受态细胞”。它可是分子生物学领域极其核心、绝对不可或缺的工具性概念。通常来讲，有关感受态的科普或者教学文章，常常会被写成冷冰冰的实验手册，或者高深莫测的论文摘抄。而我的写作目标是要在比赛里崭露头角，那就一定要超越这种传统的教条，凭借极强的代入感以及细节真实感去打动读者。
我需要深度揣摩目标读者的“搜索人设”与“核心痛点”：
1. 哪类是目标客户呢？绝不是连生物知识都全然不懂的新手。最为精准的读者群体，是那些正在经历分子克隆困扰的实验人员、正在攻读硕士或博士学位的学生、遭遇挫折的科研助理。他们对这东西大概有所了解，然而时常面临失败：没有长出菌落、效率十分低下、冻存过程中细胞死亡。
2. 客户会以怎样的方式进行搜索，他们想看的又是什么呢？实验室之中，冰箱被打开后，呈现的是那些使用了一半便被丢弃的高价商业化感受态，亦或是贴着亲手书写标签的自制片。搜索关键词涵盖“感受态细胞如何使用”、“转化后长不出菌落该如何解决”、“感受态选择DH5a还是TOP10”、“自制便宜感受态的方法”。因而，标题必须能够直接触及这类具有实操性质的痛点，运用最为通俗直白，甚至带有些许悲壮意味的对话感去将他们抓住。
3. 怎是我的战略呢？我决然不可写成那种类似“理论总纲”样式的文章，那种会如同所有别的AI输出一般，恰当却又乏味。我打算撰写一篇具备失败经历、反复实验、疑惑、同时还有经时间消磨后的经验积淀的散文类笔记，得让阅读进程好似有位师兄或者师姐在你进行跑胶操作时，凑到跟前递来一杯咖啡，为你详细回顾他们此前三年是怎样被这个微小的细胞折腾随后又将其制服的。文章有着顿挫之处，有着随意之态，甚至存在偶发的离题情况，可这些都是为了营造出那种独一无二的真实相处感。
我得去构思那“标新立异”的切入点，多数文章讲的是“什么是感受态”、“如何制备感受态”，我要设定一个极为暗黑的基调，那感受态细胞，实质上是一种经由人为制造出来的、极度脆弱的“人造病人状态”，它并非健康的生物，而是一种为了能够吞噬外源基因就被化学手段或者电流弄得千疮百孔的处于生与死之间的形态，这个比喻极少有人能够坦率地写出来，然而每个细胞分子生物学实验者心底里都清楚这一点。我要自始至终铺垫这种“脆弱”与“拯救”并存的共生矛盾。
我需确定语言格式以及细节填充，得避免结构上那种堪称完美存在的对称感，去营造一种真切的、带有毛糙特质的书写之感，句子长短呈现出极为剧烈的差异情形，有的仿若一个气息微弱到极点的实验记录碎片，有的又如同是半页在等待胶凝进程里随手写下的自我安慰之语。就此，标题我打算设定为：“每次转化都要碰运气的感受态细胞，究竟该如何去进行选择？”，其长度为32字，表述直白且高度涵盖搜索意图（“怎么选”）。
最终产出是充满实验室生活、个人挣扎且具画面感的某种书写，所有准备都指向它，以下是正稿。
最磨人的不是大分子实验，是感受态细胞到底怎么选。
那天晚上快十二点了，我还在冰浴。
在上周于某宝所购买的物品之中，有三管被冻于冰箱里的DH5α，其包装之上写明转化效率大于10的8次方，然而，上次在涂完板子之后，竟然连一个菌都未曾生长出来。
当时我真的很想把这管子里的东西冲进下水道。
说是“感受态”——怎么就那么不能“感受”呢？
是我，在冰上，又站了两分钟，那管子里头的细胞，冰渣子，缓缓化成一块，软塌塌的，灰白沉淀，恰似个，不该存在的，微生物灵魂。
感受态细胞到底什么来头
要是非得进行解释的话，那便是先给大肠杆菌洗一场冰水状态的澡，接着把它浸泡到氯化钙之内，完了之后又给它洗一场处于42度的热水澡。
细胞冷不丁被冻傻了，又给烫晕了，膜上就开了些小孔。
那后续如何呢？跟着然后是，你将外源的DNA给予它，它结果就在那种意识模糊的状态下把这些物品吞咽进去了。
这状态，压根儿就不是所谓的“最适状态”，而是，更偏向于，一种，经由人为打造出来的，生理方面的错乱之态。
原是一种病态，（这般讲听起来稍欠严肃，可就是此道理）。钙离子将细胞膜磷脂双分子层搅成液晶相，核酸酶于外膜与内膜间被迫离开，腾出一些供DNA得以钻进去的缝隙。
为什么我做的板子总是什么都没有
有些人可能会说，你转化效率不够呗。
然而问题在于，先前我所购买的那个品牌，在转化 pUC19 时能够长满一整个板子，可是一旦到了连接产物的情况，就变得萎靡不振了。
稍后，我查阅了数目众多的帖子，接着，询问了实验室所有的师兄弟姐妹，随后，大家察觉到，感受态这一事物如同买彩票一般，批次之间的差异能够大到使你对人生产生疑惑。
质粒大小太重要了。
大于30kb的重组质粒，会直接将你抛入全然的绝望之中。转化环状质粒与线性质粒时，二者效率的差距能够多达100倍。
另外，连接之后产物的体积，绝对是不可以超过感受态细胞体积的十分之一的，不然的话，想都不用去想，那肯定是长不出来的。
冷！热！转！
每次做转化，最重要的就是那只小管子。
42度热激45秒 — 就是个神奇的诀窍。
曾有说明书标明为60秒，亦有人称是90秒，而我自身通常的经验是45秒恰好合适，管子里头那一小点细胞糊刚刚能被烫出一个口子，且并未被彻底烫死。
但关键是什么？
热完要立刻丢回冰上，千万不能手抖。
在冰上放置更长时间，细胞才能够将那在瞬间开启的通道予以封闭，进而把质粒包裹于其中。
小孩刚进实验室进行操作，用EDTA配制了EP管，热激之后在手中轻微转动，又做了晃动动作，结果不言而喻，第二天呈现的全是白板状态。
买现成的，还是自制？
这个问题在实验室里差不多能吵一架。
受商业化影响的感受态的确具备稳定性，各项指标均记录于说明书之中，如此一来你心里便有了底数。诸如DH5α、TOP10这类最为常用的菌株，购买之后能够直接加以使用，无需为冻存条件以及菌龄方面的问题而忧心。
但贵啊。
一支容量为100微升的，价格便宜的大概需要七八十，价格贵的则要一百多块。做的次数多了，根本无法承受其消费。
我基本上是自己做，成本不到商业产品的十分之一。
存有那么一种类似“大厨”的精神，当菌液培育至OD600的值处在0.3至0.5这个范围时，就得毫不迟疑地放置到冰上，接着使用冰冷的氯化钙进行清洗、重新悬浮、分开装盛，随后快速冷冻到零下80度。
作出那批感受态，次日于板子上涂抹，菌落呈现出稀稀疏疏半板的状况，不过勉强还算能够满足使用需求。
千万别反复冻融
我要强调这点。感受态细胞最怕你心软把它放回冰箱再拿出来。
每次解冻再冻回去，活性啪一下就掉30%以上。
于是，我的习惯做法是，将其一次性分装成为一管100微升的量，采用用一支就解开一支的方式进行操作。在解开的时候，可以放在冰上5至10分钟的时间，千万不要急急忙忙便拿那手指头去捂热它，。
内壁稍微暖和那么一点儿，里头的细胞便开始动用它们那仅存的些许能量去进行代谢了，感受态就这样消失不见了。
不管怎样，每次完成转化以后，当天夜里会做一个梦，梦里自己站在冰水混合物当中，随后被丢进了42度的水浴锅。
还好醒来的时候没有变成电转的那个高压电脉冲。
电转才是大佬，我不配
化学法和电转的差距，几乎是你用手机手电筒去比探照灯。
电转效率直接比别的高出一到两个数量级，每微克DNA会有108个转化子，还会有109个转化子，甚至会有1010个转化子，有时候我对于这个数字都不敢相信。
但是要专门的家伙事儿，电转仪、电击杯，那玩意儿贵得离谱。
电转液，它得始终持续维持在处于冰的状态之上，离子的浓度，要把控控制到极为极其低的程度，不然，一旦进行通电的瞬间时刻，就会出现放电弧的情况，进而把细胞给烧掉了。
对于我而言，是不存在那样的条件的。通常情况下，要是进行文库构建或者大片段DNA的转化操作，会运用这个配置。然而，我推测我们当中的大多数人，依旧在与氯化钙处于纠缠的状态之中。
有一种死法叫菌落长成大杂烩
实验室里真实见闻。
一回，我于挑选平板那儿瞅见了一片密麻麻的菌落，忙活一整天，本以为总算拿到阳性克隆了。然而一经鉴定，全都是遭污染的杂菌呀。
事过之后才明白，在热激的那个时候，空气中存在的东西掺和进去了。其操作并非十足无菌，如此一来，细菌生长得比你所拥有的质粒载体还要繁茂。
因此，得培育出手动挡的良好习惯，——解冻之后不可以过多地进行呼吸，枪头必须是新的，打开盖子的时间需要压制到最低限度。
存在着另外一些更为诡异的状况，卫星菌落在阳性克隆的周边悄然浮现，在使用牙签去挑的时候，根本无法分辨清楚谁主谁次。
每当涂抹完板子之后，都得进行祈祷，期望明天的菌落状况，既不是相互连接形成一片，也并非仅仅是一个都不存在。
这种僵局，真的没救吗？
到后来，我察觉到了一种相对愚笨的方式，那就是，每当获取到新一批次的感受态，或者是自己新制备了一批的时候，便会以小规模的形式对一个质粒进行预先转化。
拿着一空的Vector，涂抹半块板子，次日起先转过天亮瞧一瞧转化效率是否能够超过106 cfu/μg。
如果连一百个菌落都长不出来，那赶紧不用它。
也别等连接结果。
我已经浪费过太多连接产物，往那些就剩一口气的感受态里加了。
有时候问题是出在冻存液上
曾经有一回，我帮我的室友去做转化这件事，他从处于 -80 度的环境中抽取出了一管感受态，然而转化完成之后啥都没有生长出来。
我们俩在37度摇床旁边站了老半天。
随后才发觉他所添加的冻存保护剂居然是甘油，然而其浓度究竟是否正确没法知晓。感受态细胞进行长期保存时，甘油终浓度通常而言得是5% - 15%，倘若过少，水分子结冰便会将细胞弄破。
还有的用7% DMSO，但不如甘油靠谱。
就算拿来的时候，那标签写得模模糊糊，可谁又能晓得，那里面的感受态细胞，究竟是死是活哟。
最不能理解的是冷击的时间
说明书里冰浴静置的时间，有的写25分钟，有的写30分钟。
我就想，这差了5分钟到底能怎么着？
经过查阅诸多帖子发觉，只要于冰之上放置达到足够长的时间，像是大概二十来分钟这样，钙离子与质粒能够形成具备DNase抗性的复合物进而附着于细胞的表面，这大约是热激之前颇为重要的一项准备工作。
只是有一回，时间特别紧张，仅仅放了15分钟，在42度热激完之后涂的板子，虽说长得速度并不快，然而也长出菌来了。
所以我说感受态这事儿没有绝对的定论。
我曾经也相信科学的确定性
头两年，刚进入实验室时，我认为能用精确的计算公式或者标准操作流程去化解一切问题。
时间越久，那种感觉的状态持续得越长，就越发觉得，在分子生物学里头，好多地方实际上是画着一个问号的。
他们说氯化钙转化原理还没有公认的定论。
有一种假说提出，钙离子致使细胞膜磷脂层进行了某种形式的重排，进而使得DNA能够钻过去，然而关于其背后分子细节的普遍解释目前仍处于假设阶段。
对于我们每一个人而言，每天都要对着这些Eppendorf管，来回摆弄的事物，正是连科学家本人，都还没有完全弄明白的事物。
这挺讽刺的。但也是真的。
不慌，菌落终究会长出来的
写了这么多，可能都在抱怨这种实验有多磨人、多玄学。
但如果你正处于转化失败、板子上空空的状况，不要灰心。
切莫一旦遭遇失败便质疑感受态存在问题，需先去查验抗生素浓度是否恰当、质粒质量是否良好，而后再去审视涂板子之际有无将连接产物加热损坏了。
把你的连接产物稀释一点点，再做一次涂板。
有些平板太湿，菌液在上边敷不住，那就倒置在37度等它干。
总会有人在一个深夜里数着菌落，然后用那支笔记录某个克隆号。
那片小白点就是你要拯救的奇迹。
如果你实在被折磨到不行，放一放。
去外面买一杯热咖啡，体会细胞所历经的，三十九摄氏度之外更高一度时的热激，它们最终会明白你。
