昨天晚上，我又搞砸了一个实验。
那荧光信号微弱得好似从未充足摄取过食物的蚊子一般，整个呈现出来的跑出来的图混乱不堪，导师瞧见之后仅仅只是发出叹气声。
我盯着那台冰冷的机器，心里烦透了。
为什么别人做得那么漂亮？我到底哪里错了？
流式抗体选择什么牌子好？
牌子不重要。真不重要。
切勿迷信那些大牌，也不要贪图便宜。关键的是什么？是进行验证，是进行验证，还是进行验证！你所购买的抗体，在你所研究的细胞上，其他人是否使用过？是否发表过文章？
这才是硬通货。
我所经历过的，最大的那种坑，是因看到参数呈现出漂亮的样子，从而购买了一个价格高昂的。然而结果怎样呢？它跟我靶细胞之上的抗原表位，之间根本就不存在匹配的情况。钱就这么白白浪费掉了，时间也全都被浪费了。
后来学乖了，先搜文献。看人家用啥，我跟着用啥。
少走很多弯路。
流式抗体染色步骤有哪些？
说明书？那玩意儿太理想化了。
实验室条件千差万别。我总结的血泪经验：预实验！必须做！
一开始先取用少量的细胞来进行尝试，接着对抗体开展滴定操作，从中寻觅到一个最佳的浓度，千万不要一开始就依照说明书所规定的最高浓度去添加，否则那并非是在做实验，而纯粹是烧钱行为。
封堵？有人讲务必得这样，有人讲没必要。我的经历是，要是背景高到令人咋舌，那就老老实实地采用同型对照或者血清进行封堵一番。
染色体积，宁小勿大。浓缩了，反应才充分。
但也不能太小，细胞搅不开，全成团了，更麻烦。
进行清洗，一定要确保清洗得干干净净，残留下来的抗体以及荧光染料，乃是背景噪声的主要源头所在。通常情况下，我会清洗两至三遍，并且要轻轻地进行吹打操作，千万注意不要把细胞给弄死了。
最后上机前，别忘了过滤。
细胞团块堵了仪器管路，维修费比你所有抗体加起来都贵。
流式抗体结果分析怎么看？
拿到数据，别急着下结论。
先来查看对照情况，进行同型之间的对照设置，还有阴性细胞的对照设定，以及FMO对照设置。当这些全部设置妥当之后，你所进行的阳性门和阴性门划分才能够精准无误。
门控策略得逐步推进，首先从使用 FSC/SSC 来圈定活细胞，接着再去圈定单细胞，最终查看荧光情况。
别一上来就盯着那点荧光信号。
偶尔信号呈现出微弱的状况，并非必然意味着抗体存在不佳的情况，极有可能是你自身细胞所处的状态欠佳，又或者是靶抗原自身的表达量原本就处于较低的水平。
复杂程度较高的多色实验，补偿这一环节必须要精细调好。对于是机器自动进行补偿这种情况，可千万别完全相信，还得手动再次略微调整一番。
我见识过数量众多的人，相关补偿未能调试准确，这样子，两个通道的信号就串连到一块儿了，进而导致整个数据完全错误。
绘图之际，究竟选用直方图抑或点图呢？这取决于你欲展示的内容。若想对表达强度予以比较，采取直方图具有直观性。要是想看两个标记的共同表达情况，运用点图会更为清晰。
别把图做得花里胡哨，关键是信息清晰。
说到底，流式属于一门手艺活，抗体仅仅是工具罢了。最为关键的是，实验者要有耐心以及思考的能力，每一个步骤，都得去追问究竟为何如此。机器是没有灵活思维的，数据也是固定不变的，然而人却是充满活力且具有主观能动性的。
现在我再看到那台机器，心里平静多了。
曾经那被视为令人产生恐惧之感且身形巨大无比之物，如今已转变成为一个需以耐心与之开展对话的伙伴。一旦经历失败，便如同它在向你传达这样的信息：嘿，在此处你所做的存在不妥之处。
慢慢来，比较快。
