其实挺奇怪的。
搞动物实验的那些人，将近十分之九都尝过ELISA的苦头。不是板子存在不干净的状况，就是背景呈现出偏高的情形，要不就是OD值波动好像心电图一般。你一回回地去操作，一回回地重新开始，最终甚至连自己都心生疑虑，是不是老天爷在隐晦示意我转行去从事养猪这一行业？
说实话，我自己也经历过那种崩溃。
有一回，对小鼠血清当中的某一个细胞因子进行检测，前前后后折腾了长达两周的时间。更换了三个不同批次的试剂盒，还更换了两个来自不同厂家的酶标板，甚至连孵育的时间都精确到了以秒为单位。然而结果怎样呢？复孔的CV值竟然还是飙升到了15%以上。
老板走过来看了一眼，叹了口气，没说一句话，走了。
那个沉默比骂我还难受。
动物ELISA试剂盒到底该怎么挑？
很多人上来就问：“你家试剂盒灵敏度多少？”
我明白，这属于基本功范畴。然而说实话呀，仅仅去看灵敏度那是不行的。你把高灵敏度的试剂盒拿回来，样本基质要是和它不匹配，依旧会出现问题的。
尤其动物样本。
血清，不一样，血浆，不一样，组织匀浆，不一样，细胞上清，不一样，甚至粪便提取液，也不一样。你所用的那个试剂盒，其校准品基质是什么，是否与你样本相匹配，这些问题，厂家不会主动告知你，然而你必须询问。
我见过有人用人的试剂盒去测猪的样本。
不许笑，确实存在有人这般去做的情况。其呈现出的结果是，背景高到好似有他人拿着刷子涂抹了一层色彩上去。
样本保存不好，再好的试剂盒也救不了你
这个是老生常谈了，但还是要说。
动物样本不少时刻都是采集完后放置在那儿，等待凑集到一批之后再进行检测。你冰箱里那些在零下八十摄氏度冻存了半年的血清，经历了反复冻融三次的情况，你还期望它能够呈现出好的数据？
不可能的。
我有着这样的习惯，那就是对样本进行分装，对于一次性就会用完的量，绝对不会去反复进行冻存与解冻操作，在采集完血液之后，要尽快去分离出血清，还要尽快完成分装，并且尽快将其冷冻起来。
另外，溶血样本，直接扔掉。
别舍不得。
操作细节，决定了你的数据能看不能看
不少人认为ELISA在于加样，在于孵育，在于洗板，在于显色，在于终止，在于读值，这有啥难的呢？
但真正做过的人都知道，每一步都有坑。
洗板若洗得不干净，那么背景就会高。孵育温度倘若不稳定，结果便会漂。加样之际要是产生了气泡，那个孔的数据基本上就废掉了。
特别是用于针对动物的 ELISA 试剂盒，其中不少不少是那些针对低丰度靶标的，哪怕是极其细微毫无察觉的一点点操作误差，都会被显著放大。
我自己的经验是：
洗板的时候，每孔至少洗五次，最后一次拍干
孵育的时候，把板子放在湿盒里，避免边缘效应
加样的时候，枪头贴着孔壁打，别直接往孔底戳
听上去都属于小事情范畴，然而，所有这些小事情累加起来，便形成了你那张漂亮的标曲以及漂亮的CV值啦。
为什么你的标曲总是不好看？
这个问题我问过很多人。
有人讲，问题出在标准品复溶这一环节没妥善完成，有人称，是稀释倍数出现了出错状况，另外有人表示，是板子自身存在问题。
都有可能。
但我说一个你可能没注意到的点：标准品的稀释方式。
许多人偏好借助枪头反复进行吹吸以此来实现混匀，自认为如此这般速度甚快。然而事实上，这般行径极易萌生气泡，同样极易致使蛋白发生变性。
具体做法这般：先是轻轻颠倒以使均匀混合，又或者借助旋涡振荡器以低速达成均匀混合 ，混合完毕后静置些许分钟 ，促使气泡完全消失不见 ，之后方可使用。
还有，标准品的稀释管，用低吸附的。
别省那个钱。
结果解释，比操作更让人头疼
你的数据弄出来了，OD值呈现出很好看的状态。然而，所计算得出的浓度，和预期相比差了一许多。
这种情况，我见过太多次了。
原因可能是：你的稀释倍数算错了。
亦或许是这样的情形：你所拥有的样本从一开始便具备存在干扰作用的物质，举例来说，像是类风湿区域的因子，还有异嗜性方面的抗体。
另外一种情况或许是，你所挑选的试剂盒，其抗体展现出的交叉反应性，并未达到你预先设想的那般良好程度。
我师妹曾有一回对小鼠的某一个细胞因子进行检测，其结果呈现出来比正常数值高出了十倍之多。她原本认为是样本方面存在问题，进而重新采集了一批样本，然而结果依然是高。最终经过查找发现，试剂盒当中的抗体跟另一个与之同源性非常高的蛋白产生了交叉反应。
要是碰到这种事情，说明书里可不会写得特别明白，你得亲自去查找文献，还得去询问技术支撑。
说到底，动物ELISA就是个手艺活
没有哪个试剂盒是万能的。
你挑选了A家的，或许其灵敏度较为良好，然而特异性欠佳。你更换成B家的，特异性得以改善，可是重复性却又不符合要求了。
你所要去做的事情，并非是寻觅一个堪称“最好”的试剂盒，而是要去寻找到一个，最为适配你所拥有的样本的试剂盒，最为适配你所构建的实验体系的试剂盒，最为适配你所具备的操作习惯的试剂盒。
一次次地跑，一次次地优化，直至你获取到那个能让你生出“嗯，正是这个数据”之感的成果。
干这个就像做饭。
同样的食材，同样的调料，不同的人做出来味道就是不一样。
你的手法，你的经验，你对细节的把控，这些都在决定，你最后端上来的那道菜，究竟是一盘能够堂堂正正被摆放在餐桌上的，还是一盘会被毫不犹豫直接倾倒去垃圾桶里的。
所以别老怪试剂盒。
请问先得问问自身,你的样本处理是否已到位了呢,你的操作是否规范了嘛,你的数据解释是否合理了呀？
当你把这些想透彻了，你就会察觉到，那些致使你陷入崩溃状态的问题，实际上都是能够找寻到答案的。
