我予以承认，当首次听闻“荧光定量PCR”这六个字之际，我脑海中所浮现飘过的画面乃是一台闪烁着诡异绿光的机器，且旁边站立着身着白大褂之人，其手中握持着试管，那表情严肃得仿若我初中班主任那般。
但其实，它没那么吓人。
甚至有点……接地气？
用于荧光定量的PCR仪器，确切来讲，是一台具备能够“看见”DNA数量发生变化功能的仪器。要知道，DNA这类物质，人的肉眼无法看见用手又触摸不到，假设你想要了解它的数量究竟有多少，是否存在以及有没有正在变多的情况，该如何去做呢？
荧光定量PCR就是那个替你“数数”的工具。
它怎么数的呢？
借助荧光，如同于黑暗之中开启手电筒，光线越发明亮，意味着前方存在之物越繁多。荧光定量PCR亦是如此，它朝着样品里添加某一种会发出光亮的染料或者探针，DNA每进行一轮复制，荧光便会明亮些许。机器紧盯着那一丝光亮，光亮越强，表明DNA数量越多。
这套逻辑，简单到有点粗暴，但真的管用。
原先我一直觉着呵，进行那种科研工作、开展那样的实验操作，必定是得拥有智商高达一百八程度的人才能去触碰的。然而往后却发觉了，就那荧光定量PCR这个事物，好多的操作都是属于那种如同傻瓜都能做的方式。你只需把样品放置到里面去，将程序给设置妥当，让机器自行去运作，等跑完之后就会出现一连串的数据，然后你对着这些数据去查看结果就可以。
当然，数据怎么解读，那确实需要点经验。
有时候数据会骗人的。
比如说，你原本仅仅打算检测某一个基因，然而结果却是，样品偏偏被污染了，荧光信号呈现出随意跳动的状态，你满心以为自己发现了一个极为重大的发现，以至于兴奋得几乎要跳起来，可是随后进行复查的时候，哎呀，原来是手抖了那么一下，在加样的过程当中加错了。
这种事儿，谁干谁知道。
荧光定量PCR最大的优势，是快。
以前进行普通PCR操作时，完成该操作后还需要去跑电泳，进行跑电泳操作时还需要进行染色、拍照以及分析等一系列流程，如此这般折腾下来大半天的时间就没了。而荧光定量PCR又是怎样的情况呢？是在运行过程中就可以边进行边查看，当运行结束后结果能够直接呈现出来，这样节省了相当多的时间。
时间就是命啊，朋友们。
特别是在某些需要迅速做出判断的情形之下，像是食品当中掺假与否、种子是不是纯种以及某种微生物是否超标之类的情况，荧光定量PCR投入其中以后，短短几小时就能得出结果，无需等待。
还有人用它做亲子鉴定。
并非你看错。现今，尽管亲子鉴定更多采用测序方式，然而荧光定量PCR同样能够完成此项工作。其原理依旧是过往的原理，即检测若干特定的基因位点，对照荧光信号的强度，以此判定是否为亲生关系。
但这事儿我劝你别自己瞎搞。
真想弄清楚，前往正规的机构，别在网络上购买一个质量不佳的试剂盒，然后在自家进行摆弄，要是弄出错误来，那引发的家庭矛盾可就严重了。
对了，荧光定量PCR还有个名字，叫qPCR。
有时，它也会被写成RT-qPCR，然而，那是经过添加反转录的版本，其用途是用于检测RNA的，千万别搞混了。
说实在的，我当初在学习qPCR之时，最为头疼的便是“Ct值”这个概念，Ct值所指的是，荧光信号抵达某个阈值所需的循环数，Ct值越小，表明样品里目标DNA越多。
但很多新手会搞反，以为Ct值越大东西越多。
并非如此。Ct值越小，表明你起始的点就处于较高的位置，没几下就呈现出亮起来的状态。Ct值越大，意味着你起始的点处于较低的位置，经过很长时间的运行才好不容易亮起来。
qPCR的引物设计为什么那么重要？
引物设计不好，整个实验就废了。
引物好似一把钥匙，得精确地插进DNA的那把锁当中。锁配准了，门就开启了，扩增便顺利；鎖没对准，钥匙插偏了，扩增要么毫无结果，要么结果杂乱无章。
诸多的人贪图省事之举，在网络上采用现成的引物系列，进而也不去验证其特异性，径直就拿到机器上去运行。
结果跑出来一堆非特异性扩增，数据根本没法用。
所以啊，引物设计一定要亲手过一遍，别偷懒。
荧光定量PCR的染料和探针到底选哪个？
印染材料价格低廉，具备广泛的适用特性，可应用于任何目标对象，然而其专一性欠佳，所呈现出的信号存在引发背景噪音的可能性，每种情况都有相应表现。
探针贵，但精准，能锁定特定序列，背景干扰小。
选哪个？
留意预算状况，考量实际需求，如果仅仅是进行初步的筛查工作，那么染料便已足够，要是开展严谨的定量分析，在拥有经费的情况下则选用探针。
数据怎么分析才靠谱？
数据跑出来了，一堆曲线，一堆Ct值，然后呢？
首先要看扩增曲线，判断其呈现出的 S 型是否具有良好的视觉效果，以及其平台期是否具备稳定的特性。接着来看熔解曲线，查看其中是否存在杂峰情况，同时还要看是否存在非特异性扩增现象。
两步走完，数据才敢用。
很多人跳过熔解曲线，直接看Ct值，觉得差不多就行了。
不行。差很多。
曾经有一回，我为朋友查看数据，那会儿他径直越过熔解曲线这部分，还声称“机器运行完毕必然不会有问题”。而后我瞧了瞧熔解曲线，嘿，竟然多出来一个峰，这表明存在污染或者出现了引物二聚体的情况。最终致使他先前所有的结论都得推翻重新再来。
荧光定量PCR这玩意儿，快是快，但你得对数据有敬畏心。
它不会主动骗你，但你要是马虎，它会狠狠地把你骗进沟里。
新手最常犯的三个错误
第一点，样品添加量不准确。不要认为多一滴或者少一滴没什么关系，荧光定量PCR对于量的要求十分严格，稍有差异，Ct值就会相差很多。
这是第二个，对照设置并不齐全，并没有阴性对照，也没有阳性对照，一旦出了问题，根本就不清楚究竟是试剂方面的问题了，还是属于操作方面的问题。
第三个，是反复冻融试剂，荧光定量PCR所用到的试剂娇贵至极，一旦进行反复冻融，其一，酶活性就会下降，其二，结果会愈发糟糕。
这三个坑，我全踩过。
踩完之后，人就老实了。
荧光定量PCR的未来会怎样？
越来越便携，越来越傻瓜化。
现今已然存在那种呈掌上型的qPCR仪了，其大小如同手机，能够将其携带至现场进而直接进行检测。在未来，有可能在农场里，在食品厂里，在海关处，甚至是在家里，均可得以使用。
当然，价格得降下来。
如今，一台稍微好一些的qPCR仪，价格处在几万至几十万的范围之内，并非所有人都具备购买的经济能力，能够将其买下。
然而技术处于进步态势，成本呈现下降趋势，终有一日，它会如同当下的手机摄像头那般，所有人都能够使用。
到那时候，检测基因就跟测血糖一样简单。
你想想，是不是挺科幻的？
但技术这东西，永远都是先科幻，再日常。
荧光定量PCR，先是成了实验室里的宝贝，而后又变为行业的标配，再到未来有可能成为家庭常用工具，它正走在这样一条路上。
回过头去看，它仅仅只是借助了DNA复制与荧光信号之间存在的那一点点细微关系。
往前看，它还有很多潜力没被挖出来。
就像我开头说的，它没那么神秘，也没那么吓人。
那你只需牢记这么一句话：荧光定量PCR，呈现出的是借助光去对DNA加以计数的仪器。”。
数清楚了，很多问题就迎刃而解。
