我靠，又买错抗体了。
这并非头一回。置于实验室冰箱内的那几管流式抗体, 耗费了数千元, 然而上机运行完毕瞧去, 背景高得仿若夜空当中的月亮, 阳性群与阴性群混淆成一团, 根本无法区分开来。导师路过瞥了一眼, 未置一词, 但其眼神——你是明白的。
流式抗体此物, 若言其简单, 亦可谓简单, 它乃是一种带有荧光素的蛋白质, 会与细胞表面或者细胞内部的抗原相结合。然而要说其复杂呢, 着实能够将人逼至疯狂状态。
不同通道怎么搭配才不打架？
有着不少人初次购买流式抗体, 径直依照文献去买。随后发觉, 文献之中所采用的是Fortessa, 而你用的却是CytoFLEX, 二者的激光配置存在差异。更为糟糕的是, 你的绿光通道只是仅有一个, 人家却使用了三个, 可你却硬是将FITC和PE一同放置, 补偿调节到让你对人生都产生怀疑。
事实状况为: 不一样的荧光素相互之间会存在光谱重叠现象, PE和PI别放置在一起, 除非你期望观看彩虹景象；PerCP和PE CY5同样属于常见的相互干扰或不兼容组合；故而在你进行下单操作之前, 最好预先确认一下你所使用的仪器配备有哪些激光器, 以及每一个激光器能够激发出哪几个通道。
克隆号到底重不重要？
重要到爆炸。
同是那个靶标, 就像 CD4 这般, 存在着几十个各异的克隆号。像 SK3、RPA - T4、OKT4, 它们每一个克隆号所结合的抗原表位均不相同。你使用 OKT4 得出的结果呀, 跟运用 RPA - T4 得出的结果或许相差甚远。特别是当你进行多色组合之际, 不同克隆号之间还极有可能产生空间位阻, 一旦有一个抗体占据了位置, 另一个就难以绑上去了。
所以不要只看抗原名字，克隆号才是灵魂。
买分装的还是买原装的？
这个问题我问过好多师兄师姐。
存在有人对我讲, 大包装进行分装后价格便宜一半, 且效果相近。又存在别人声称, 分装的抗体稳定性欠佳, 经过几次冻融就会失效。我自身的经验表明: 倘若你能够在一个月之内将其用完, 分装好问题不大。然而要是你所做的是稀有样本, 或者实验周期格外长, 那就老老实实去购买原装的小管。
即便如此, 在进行分装操作期间, 切勿应用普通的EP管, 毕竟诸多蛋白都会吸附于管壁之上, 损失率竟可达30%。所以, 需选用低吸附管, 或增添载体蛋白。
要不要做滴定？
这个问题我敢说，十个做流式的里面，有八个不做滴定。
这是为何? 是嫌麻烦。认为说明书上面写着有推荐用量, 直接添加就可以了。然而实际情况是, 说明书里的推荐用量是针对某一种特定细胞类型而言的, 你的细胞表达量有可能并不一样。要是加多了, 非特异性结合会急剧飙升, 背景高得就如同雪崩一般。要是加少了, 阳性群会拖尾巴, 分群也不清楚。
进行滴定这件事实际上并非很复杂, 选取一个样品, 制作五个不同的梯度, 分别是一比五十、一比一百、一比二百、一比四百、一比八百, 梯度流程完成之后寻找那个信噪比处于最高状态的浓度, 此项操作花费两个小时, 却能够节省你两个月用于修改论文的时间。
死活染料要不要加？
要。而且要加对通道。
那些已经死亡的细胞, 会以非特异性的方式去结合差不多所有的抗体, 你所见到的那些呈现阳性的细胞群体当中, 大概有三分之一是处于死亡状态的, 如果不将它们排除掉, 那么你所得到的数据就是没有价值的。
当下主流所采用的是死活染料, 就像LIVE/DEAD系列那般。要留意挑选一个在你的样本里不存在其他荧光信号情况的通道。比如说你开展绿色通道的FITC操作, 那就不要运用绿色通道的死活染料。应选择远红类别或者紫光通道的。
保存和运输的那些破事
流式抗体怕光、怕热、怕反复冻融。
收到抗体后, 要在第一时间做到分装, 而且还要进行避光保存。倘若实验室的冰箱平时经常会有人去开关, 致使温度处于不稳定状态, 那就要放置在4度, 但不要放置在负二十度。许多荧光素在经过反复冻融之后, 荧光强度会直接折半。
运输之际, 务必得是冰袋加上避光盒才行。有一回, 我出于贪图便利省事的缘故, 让快递直接那般 Naked 寄送, 然而抵达之时, 液体已然转变成为像棉絮状的形态了。那一管抗体价值两千块呢, 就这么直接给丢弃掉了。
预算不够怎么办？
具备多种颜色的一个panel, 十几管抗体累加起来, 轻轻松松就能达到上万的数量。要是实验室经费存在限制应该如何处理呢?
我所用的办法如下, 核心靶标选择购买大品牌的, 辅助标记能够采用一些国产的、或是性价比高的替代品。就像CD3、CD4、CD8这类经典指标, 大厂的克隆号以及荧光素历经大量验证, 稳定性良好。然而一些冷门指标, 或者你仅仅是做个初筛, 那么可以尝试国产品牌, 如今国产抗体的质量相较于以前提升了许多。
还有, 要与代理商维持良好关系, 众多代理商在年末清理库存时, 会存在折扣情况, 不要因难为情而不去询问, 询问一次或许能节省两千元。
写在最后
流式抗体选对了，实验就成功了一半。
请勿盲目跟风, 勿图省事。针对每个抗体都要进行滴定操作, 对于每个panel都要来做单阳对照, 在每次实验时都得添加死活染料。虽说如此会麻烦, 旦数据变得干净, 那么审稿人便不会追着询问 那些令你头疼的问题。
那些放在冰箱里、买错了的抗体, 把它们扔掉。留着它们仅仅是在提醒自己当初是多么地冲动。在下次下单以前, 要多去查询、多去询问、多去对比。
总而言之, 我已然形成了一种习惯, 那便是在进行购买之前, 先将荧光光谱查看器予以开启, 把通道冲突逐一彻查一番, 接着去查询克隆号的文献引用次数, 最终才开展滴定操作。
虽然还是偶尔会翻车，但至少翻得不那么惨了。
