荧光标记抗体，听起来像是什么高科技实验室里才会出现的东西。
但其实，它没那么神秘。
查找“荧光标记抗体”, 尽是专业术语, 像“激发波长”等, 看得人脑袋发懵。我初接触亦是如此, 被弄得晕头转向。
后来我发现，这东西说白了就是——给抗体加了个“亮灯”。
把抗体当作识别器件瞧, 它能够精确无误给细胞之上某一蛋白定位找到, 然而存在的状况是, 即便它成功找着了那个蛋白，你却没办法直接看得见它, 荧光标记抗体的情形就有所不同, 它携带着荧光染料, 好似一个小型手电筒，只要照一下就会发出光亮, 你借助显微镜去观察, 哪个地方发出光亮, 哪个地方就存在你所期望的蛋白。
就这么简单。
但简单归简单，真用起来，坑也不少。
怎么选荧光标记抗体？别光看颜色
很多人上来就问：“我想要红色的，有吗？”
嗯, 颜色必然是要进行挑选的。然而更为关键重要的是——你的那台仪器究竟能不能探测检测到那个特定的波长呢。
我曾目睹有人购置了远红外的荧光抗体, 然而实验室的显微镜压根不存在那个通道, 白白花费了冤枉钱。在选择之前, 要先前往查询一下你的流式细胞仪或者荧光显微镜的滤光片设置, 记住这一点, 匹配度相较于颜色好不好看而言重要一百倍。
再一个就是荧光强度, 存在这样的情况, 有些染料亮度特别高, 像PE、APC就是如此, 它们适合去标记表达量低的靶标, 而FITC的亮度相对来说要弱一点, 更为适合表达量高的情况, 千万不要在挑选时一股脑全部都选择最亮的那种染料, 不然会导致信号出现严重串扰, 呈现出一塌糊涂的状态, 最终使得数据根本无法正常查看。
荧光标记抗体怎么保存？千万别反复冻融
这个事儿，我踩过坑。
买回来的抗体, 说明书标明需“存放于零下20摄氏度”, 对此, 我依言照办。然而, 每次使用时, 都要取出使其解冻, 使用完毕后再放回原处。如此操作几次之后, 信号就逐渐越发微弱, 直至最后几乎难以看见了。
后来才明白，荧光染料扛不住反复冻融。抗体蛋白也会降解。
正确的做法是进行分装, 将一次使用的量, 分装到小的管子里面, 然后冻起来, 使用的时候用一管取一管, 不要来回折腾, 另外, 要进行避光保存, 这一点很多人都忽略了, 因为荧光染料是怕光的, 长时间暴露在光线下, 信号就会出现衰减。
荧光标记抗体能跟别的抗体一起用吗？
可以，但得小心。
有的时候, 在一个实验当中, 存在想要去查看两种蛋白表达式样的情况, 这种情况下那就需要用到两种具备不同颜色的荧光标记形成的抗体, 从理论层面来讲, 只要是它们二者的激发以及放射显现出的光谱未曾出现重叠的状况, 那么就能够达成同时进行染色的操作。
而实际状况常常致使令人头疼不已, 光谱相互重叠这种情形极为普遍, 特别是于FITC与PE之间, 有时甚至难以区分开来, 在这种时刻就必须进行补偿调节, 或者索性挑选光谱分离程度高的组合, 像FITC和APC。
另外, 要是不同的抗体是源自同一物种的（就像都是从小鼠身上所来的那种情况）, 直接一块儿去使用的话, 二抗就会出现胡乱结合的状况, 其结果便是整个片子上到处都是非特异性的信号。在这种时候呢, 要么得去挑选不同物种来源的一抗, 要么就得采用直标抗体, 从而省去二抗这一环节。
荧光标记抗体能用在哪些实验里？
几乎所有跟细胞、组织相关的实验都能用。
流式细胞术, 它是最为常见的一种技术, 在细胞悬液当中加入荧光抗体, 之后进行上机检测, 仅仅几分钟的时间, 便能够知晓不同细胞的比例情况。
免疫荧光, 针对组织切片, 或者细胞爬片, 染上荧光抗体, 于显微镜之下进行观察, 蛋白在细胞里头的位置清晰明了。
Western blot , 根本就不太可行。荧光抗体, 主要是被用于成像以及流式方面的。而 Western blot , 正常情况下会使用像是 HRP 这般的酶标抗体的。
做活细胞成像时, 有一些荧光染料, 其毒性是比较低的, 能够对活细胞进行染色, 进而可以实时去观察蛋白的动态变化情况。
自己做荧光标记还是买现成的？
这是个灵魂拷问。
买现成的，方便，质量有保证。但贵。
自身进行标记, 价格低廉, 然而耗费时间与精力。你需要拥有经过纯化的抗体, 具备荧光染料, 持有纯化柱, 还必须懂得计算标记效率。生怕弄不好标记完成之后, 抗体的活性就此消失, 荧光信号也随之不见, 最终两头落空。
我的个人所给出的建议是, 要是仅是偶尔应用一两次, 那就去购买现成的, 要是长时间针对某个靶标进行操作, 那么在你具备充足抗体以及实验经验的前提下, 可以尝试学着自己去标记。
荧光标记抗体的信号不好怎么办？
这事呀, 极其平常, 司空见惯, 信号微弱, 背景过高, 特异性欠佳, 每一位从事实验工作之人, 均遭遇过。
先别急，排查一下：
抗体浓度是不是太低了？试着提高一点。
孵育时间够不够？4°C过夜有时候比室温1小时效果好。
封闭做没做好？血清或者BSA能大大降低背景。
洗涤充分吗？多洗几次，每次5分钟，背景会干净很多。
荧光染料是不是老化了？看看保质期，或者换一管试试。
有的时候, 那个问题, 它所在的地方是最基础的操作方面。可千万别一开始就怪罪抗体不好, 得先去查查自己所执行的步骤。
荧光标记抗体真的有那么神吗？
说实话，它确实帮了大忙。
缺少它, 你无法于显微镜下看清蛋白的具体所在位置, 无法晓得哪些细胞正在表达某个基因, 无法在流式仪之中分选出你所期望的细胞亚群。
可终究而言, 它仅仅是一件工具, 工具即便再好, 也需要具备良好的试验设计, 拥有严谨的操作, 存有清晰的思维。
不该寄希望于一支荧光抗体, 去处理全部问题。它仅仅是将你无法看见的事物, 予以照亮罢了。
真正能做出好实验的，是你自己。
