你买的抗体真的是你要的那一个吗
说实话，我见过太多人栽在这个坑里了。
掏出几千块买来的流式抗体, 跑出来的图杂乱无章, 补偿调了许久依旧呈现歪斜状。而后开端怀疑机器出现故障, 怀疑自身操作不当, 怀疑整个人生。
其实可能只是……你买错了。
并不是讲你所购置的是假的, 而是它压根就不契合你所进行的那个实验。流式抗体这类东西, 看上去都称作CD4、CD8, 然而不同的克隆号, 不同的荧光素, 不同的批次, 其结果能够相差十万八千里。别来询问我是如何知晓的, 若要问, 那便是我已经交过“学费”了。
克隆号是什么 为什么这么重要
很多人买抗体只盯着目标分子看，不看克隆号。
并非你所认为的那样是同一个事物, 实际上人家所识别的确有可能并非相同的表位。存在部分表位, 在经过固定之后遭到了破坏, 还有部分表位, 在由你所提及的那个细胞亚群上根本就不会表达。随后你跑来向我询问为何染不出来, 原因在于你的抗体根本无法识别你的样本呀。
打个比方, 对于人的CD4抗体而言, 存在这样一些克隆号, 它们仅仅能够对新鲜样本进行染色, 一旦你实施了固定操作, 它就不再能识别了。你带着这样的情况去处理已经固定好的样本, 最终呈现出来的结果便是只会看到一片黑色。
荧光素到底该怎么选
这个问题我至少被问过一百遍。
进行荧光素的选择, 并非亮度越高就越好, 这是事实。你需要对仪器的配置予以考量, 还要顾及补偿的大小情况, 同时也要留意抗原的表达密度状况。对于高表达的抗原而言, 本能够选用弱一些的荧光素, 而把强荧光给予那些表达量低的抗原。
这里存在着一个众多人并不知晓的要点, 即一些荧光素于固定之后会出现淬灭的情况, 你费尽周折完完弄染料, 只是一进行固定, 信号就减少了一半, 你说这般情形下你冤不冤呀。
因此在挑选荧光素以前, 先对自己询问: 随后我会不会进行固定? 我的观测设备可不可以探测到这个通道? 补偿会不会大到致使阳性群全部消失殆尽呢？
同型对照到底有没有用
这个话题争议很大。
有些人声称同型对照属于浪费钱财, 有些人讲没有同型对照数据便无法瞅看。我个人所秉持的看法为: 存有作用但是别太过于迷信。
同型对照可助你去判断非特异性结合的情况, 然而其并非你设门所依据的唯一要素。真正起着阴性对照作用的, 最好是采用生物学阴性群体, 或者借助阻断实验开展验证。
并且, 不同品牌的同型对照有所不同, 不同批次的同型对照, 展现的情况也存在差异。你要是更换为另一个批次, 或许背景就会发生改变。因而, 不要一味地执着于同型对照, 它仅仅只是一个参考而已。
保存和使用 那些没人告诉你的细节
抗体畏惧光线, 抗体惧怕冷冻, 抗体害怕反复地冷冻再融化。这一点大家全都知晓, 然而真正能够切实达成的人并不多。
有不少人的抗体被放置于4度环境, 使用之际将其拿出, 而后又放回去, 接着再次拿出来……如此这般多次反复折腾, 其活性便下降了。你依旧处于疑惑之中, 不明白为何此次染出来的阳性率会比上一次更低。
此外, 别觉得抗体过期了仍可使用。存在于那里的过期抗体, 有的实际上依然具有使用的可能性, 而有的却已然完全不能用了。要是你心里不踏实, 率先开展一场滴定予以查看。
提到那个滴定, 这可是好多人轻易就跨过去的步骤。说明书有着明确标注为 1:100, 那你就得严格按照 1:100 来操作。但要注意呀, 你所拥有的样本、构建的体系以及使用的仪器, 它们之间很可能差距完全不同样。根本不经过滴定就直接去上样, 这就如同闭紧双眼驾驶那般盲目随意。
多色实验的搭配技巧
做两三个颜色还好，一到七八个颜色，问题就全来了。
你得思索荧光素相互之间的光谱重叠情况, 以及抗原的表达量, 还有染色的顺序。存在有的抗体需要先进行染色, 而有的则需要后进行染色, 倘若顺序出现差错, 那么最终的结果就会产生偏差。
尚有一项颇为实用的技巧, 将表达量较低的抗原搭配强荧光素, 把表达量较高的抗原配以弱荧光素, 如此这般能够实现信号分离度的最大化。
另外, 倘若你所进行的是胞内染色, 那么固定破膜的相关步骤会对部分表位产生影响, 你需要预先开展测试, 而不要待跑完数据之后才发觉存在问题。
买抗体前一定要做的三件事
查文献，看看别人用什么克隆号、什么荧光素。
问技术支撑，确认这个抗体在你那个样本和实验条件下能用。
尝试着先去买那种小包装的, 千万别一开始就直接购买大包装, 要是出现不合适的状况, 浪费钱这件事暂且不说, 还会耽误掉时间呢。
写在最后
流式抗体这件事，说难也不难，说简单也不简单。
核心在于一句话, 要去知晓你的实验需求, 要去明白你的抗体特性, 不要想当然处理呢。
进行实验那已是相当疲惫了, 千万别再让诸如“选错抗体”这般低级的失误去耗费你的时间以及感情。要多多去看, 多多去询问, 多多去验证, 这比任何事情都更具优势。
