说实话，我第一次接触荧光标记抗体的时候，整个人是懵的。
什么488, 什么647, 还有Cy3、Cy5, 这是一串数字再加上字母, 给人感觉仿佛是在挑选口红色号, 然而却又比口红色号要复杂上一百倍。后来, 做实验的时候翻车次数太多了, 才渐渐地摸到了那么一点门道。今天, 就随便聊一聊, 想到哪儿就说到哪儿。
荧光标记抗体是干嘛的？
简略来讲, 便是为抗体安置一个小灯泡, 你若想观察何种蛋白, 它就能促使那个蛋白于显微镜下发光闪亮, 这样听起来是不是颇为酷炫呢, 然而在实际开展操作的时候, 嘿嘿。
那一回, 我所见到的最为凄惨的状况映入眼帘, 师兄购置了一支价格极其高昂的荧光抗体。随后于实验之时其上样之际, 整个视野无比明亮, 仿若黑夜当中的探照灯那般。那背景居然比信号还要亮许多, 根本就难以分辨清哪里是哪里。后来一经仔细探寻发觉, 原来是抗体浓度使用得过于高了, 人家包装之上所标明的是1:200, 而他却直接依照1:50的比例给怼进去了。
怎么选标记的颜色？
这个真的很头疼。实验室经费有限，不可能把所有颜色都买一遍。
要是你所做之为常规细胞染色, 那么488与594这两种颜色当属最为稳定者。它们具有足够亮度, 背景较低, 且借助普通荧光显微镜即可进行观察。647这个近红外通道同样好用, 极为适宜用于做多标, 是因其在可见光区不存在信号, 不会与其他颜色相互串扰。
但你得记住这么一条铁定的规律, 标记的颜色, 得跟你的仪器滤光片相匹配才行。有时, 别人推荐的优质抗体, 买回来后却发现, 你们实验室的显微镜根本没办法进行拍摄, 那可真是会让人陷入极度崩溃的境地啊。
是不是越亮越好？
不是，千万别被亮度带偏。
有些商家宣称自家荧光抗体“亮度提升百分之五十”, 这般表述听起来相当厉害。然而当你将其买回来试用时发现, 亮度确实有所增加 , 只是非特异性结合也异常强烈。整个细胞之中到处散布着点状, 你根本无法分辨清楚究竟是真实信号还是背景噪音。
实际称得上优质的荧光标记抗体, 并非仅仅是单纯地往亮度高去追求, 而是在于信噪比值高。信号呈现出很强的态势, 背景处于很低的程度, 这方才是最为关键的准则。
不同品牌的差距到底在哪？
说实话，我踩过不少坑。
价格显得诱人的那种便宜荧光抗体, 实际使用时会让你陷入对人生的怀疑。我曾有过这样的经历, 买了个小品牌的荧光抗体。做了三批重复动作, 然而每一批得出的结果都不尽一致。第一批呈现出阳性结果, 第二批却显示为阴性, 到了第三批, 直接背景亮得根本无法进行观察。实验记录本之上布满了问号。
大品牌即便价格高昂, 然而好在具备稳定性。你此次所达成的是这般结果, 待下学期再度去做依旧会是此般结果。科研最惧怕的便是结果无法重复, 难道你能够接连每次都倚靠运气吗, 就好像在赌人品似的。
荧光会不会很快衰减？
会，而且衰减速度比你想象的快。
你历经千辛万苦做来免疫荧光染色, 拍摄用了长达半个小时的片子, 然而却发觉最先拍摄的那几张已经淡化到快要看不见了, 这般的痛楚, 做过的那般人都能够理解。
那么在购置荧光抗体之际, 务必要留意它的光稳定情况。存有一些品牌会开展专门的光稳定性检测, 会详尽告知你该抗体在持续激发状态下能够维持多长时间。在购买之前可千万不要忘记查看一下此项数据。
另外, 封片剂也是不容忽视的关键所在。质量优良的抗淬灭封片剂, 能够将荧光寿命大幅度延长, 达到好几倍之多, 所以千万别在这方面节省费用。
做多重染色要注意啥？
多重染色是技术活，也是最容易翻车的环节。
是不是存在着荧光标记样式不一样的抗体彼此之间会产生相互干扰的疑问, 此乃最先所要思考一番的麻烦事儿。举例说明, 像你打算同时对三种蛋白质予以染色这样的情况, 挑选了三种不同颜色的抗体, 然而极有可能出现它们之间发生能量转移的状况, 进而导致信号完全混乱交错在一起了。如此一来, 该项实验基本上也就宣告失败了。
挑选颜色之际, 尽可能挑选光谱分离程度大的组合, 像488、594、647这三个距离远的就颇为不错, 勿挑选那种靠得近的组合, 如FITC和GFP这种, 基本上难以分离。
另有个极易被忽视的要点, 即不同抗体的物种来源, 要是你的一抗源自兔, 而另外一个一抗源自小鼠, 那么二抗就很容易进行匹配。然而倘若两个一抗皆源自兔, 那你就只能采用同一个二抗去予以标记, 根本无法做出区分。
保存和使用有啥讲究？
荧光标记抗体比普通抗体娇气得多。
若害怕光线, 畏惧寒冷, 惧怕反反复复地冻融。倘若你将其买回来后并不打算立刻使用, 那么最好把它分装成小管, 每一管的量恰好足够一次实验所需, 而后在零下二十摄氏度的环境下避光进行保存。千万别整管反复拿出来解冻融化, 因为荧光会衰减得极其迅速。
使用之际同样得留意, 经稀释之后的抗体溶液最好当下配制当下使用, 放置时间久了荧光强度将会降低。我通常都是在上样前十分钟才进行配制, 使用完毕了便将其丢弃, 不会心疼。
最后说点实在的
择取荧光标记抗体之时, 别仅仅着眼于参数以及价格, 关键要看你的实验体系。他人皆称良好的, 不见得就适配于你。同样一个抗体, 于不同的细胞当中，于不同的固定方法之下, 于不同的通透条件之内, 表现或许会有着极大差异。
所以呀, 买回来之后必定得先去做预实验, 取一管细胞, 进行梯度稀释, 瞧瞧在哪一个浓度的情况下信噪比是最为优良的, 这个步骤是切不可省掉的。
就荧光标记抗体而言, 它实则为一种工具, 既不要将其过度神化, 也不要对其心生畏惧。不妨进行多次尝试, 从中找寻到契合自身实验体系的那种, 待使用得得心应手之后, 它便会成为助力你获取能量的得力助手。
