1.
你可曾实行过那般实验, 机器持续一整个下午发出嗡嗡响声, 最终结果呈现时——Ct值出现了两三个点的差值? 句号。
那时, 我正坐在实验室那破旧的椅子之上, 直直盯着屏幕神情木讷地发呆, 试剂已然历经三批的更换, 模板浓度也已依照要求进行了调整, 然而它却依旧丝毫不肯顺遂所愿服从展现。
侧边的才来不久的初入职场实习生, 带着几分怯意, 小心翼翼地问出一句: “姐, 这个数目……它可靠吗? ”。
我没说话。因为说实话，我心里也没底。
具有荧光定量功能的PCR技术, 这个东西听起来给人一种高端大气上档次的感觉, 然而, 只要是使用过它的人那可都是深有体会的——它仿佛恰似一件性格怪异的乐器, 你必须得完全摸清楚它的个性脾气, 如此这般才能够弹奏出相应的曲调来。
2.
Ct值差多少算正常？
这是每一个刚接触qPCR的人都会遇到的问题。
在网上进行一番搜索, 有人声称差值处于0.5以内可算作稳定, 有人表示1以内也是能够接受的。然而在实际进行操作的时候, 针对同一批样品运行三遍, 其结果会为你呈现出三个各不相同的数字。
首先, 光是加样这一环节, 就足够让你焦头烂额了。八连管的体积那么小, 稍微手抖一下, 结果就会相差甚远。我看过有人使用移液器的方式, 简直跟用筷子没什么区别, 那样还能准确, 那才真是见鬼了。
假如你从组织当中提取的RNA, 其纯度欠缺、存在抑制剂残留, 那么模板质量会受影响, 扩增曲线会变成一条直线。
说白了，仪器本身是准的，但人不是。
3.
为啥有时候曲线长成那样？
你必定见识过那样的曲线, 并非标准的S型, 而是歪歪斜斜、如同过山车一般的。
扩增效率不一样呗。
引物设计是否精良, 退火温度是否妥当, 镁离子浓度是否充足……这些细微之处随便哪一个出现差错, 曲线就会给脸色瞧的。
存在着另外一个坑, 那便是模板的浓度过高, 你一直误以为浓度越高便越好, 其结果却是高浓度反而对反应起到了抑制作用, 致使曲线的前端直接塌陷了。
我最初开展操作时也曾遭遇过被坑骗的情况, 那次完成跑完之后进行审视, 发现所有孔位的终点荧光呈现出大致相近的高度, 然而 Ct 值却呈现出一个比另一个更为紊乱无序的状况。随后老师走过来投以目光瞧了一下, 神情幽幽地说道: “你是不是忘却了去做梯度稀释这一操作呢? ”。
4.
内参基因要不要每次都做？
这个问题我纠结过很久。
有一些人, 会觉得存在麻烦之处, 进而偷懒不去做；另外有一些人, 会觉得反正大致情况都是差不多的, 于是随意拿个GAPDH去敷衍了事。
但是, 实事求是地讲, 要是不进行内参的绝对定量, 那就如同不带尺子去量桌子这般, 你说它究竟有多高? 那完全是依靠感觉。
要是相对定量这种情况便更不用去说了, 一旦没有内参进行校正, 那么你根本就分不清到底那是目标基因真的发生了变化, 还是上样量存在不一样的状况。
随后, 我形成了一种习惯, 无论多么忙碌, 每一次进行实验时, 都会带上最少两个候选内参, 虽说会多花费一些金钱, 不过至少能睡得安稳, 没有顾虑。
5.
熔解曲线到底看什么？
好多人在完成 qPCR 这个操作之后, 只是匆匆看一眼 Ct 值便了事, 对于熔解曲线直接毫不查看。
这其实挺可惜的。
进行扩增产物的实验时, 熔解曲线如同在做“自白”这一行为, 它会向你进行告知, 所扩增出来的究竟是不是你心里所期望的物品。
单一峰，干净利落，那恭喜你，特异性不错。
假若出现了双峰的情况, 或者出现了杂峰的状况, 甚至出现了一堆杂乱无章、七零八落的小峰这种情形……那么基本上能够判定, 你的引物在肆意妄为。
就有那么一回, 我碰见老离谱的事儿, 跑完之后瞅那熔解曲线, 嘿, 那主峰后头还跟着俩小峰, 简直跟三胞胎没啥两样, 后来又是重新去设计引物, 这才把问题给解决掉了。
因此呀, 千万别去偷取那短短几分钟的懒惰行为。去瞧上一眼熔解曲线, 这能够为你省去后续诸多修补数据的精力。
6.
标准曲线到底是信还是不信？
理论上来说, 标准曲线的R²得大于0.99, 扩增效率需处于90%至110%这个范围之间。
可问题在于, 经由你花费诸多精力制作而成的标准曲线, 极有可能在紧接着到来的下一批次实验场合里并不会再具备适用性了。
究竟是何种缘由呢? 鉴于试剂的批次已然有所更换, 仪器的灯源出现了老化的状况, 并且就连实验室的室温这一因素, 也能够对扩增效率产生影响。
因此, 千万别将标准曲线视作圣旨, 它仅仅是你手中所拥有的一个工具, 在使用之前, 最好重新去进行验证一下, 得出相应结果！
我存在一位师兄, 其为人极为狠厉, 在每一次开展绝对定量操作之前, 都会先去跑上一个小批次的标准曲线, 以此来查看状态, 虽说这一过程耗费时间, 然而他所获取的数据, 从来都未曾有人提出过质疑。
7.
新手最容易犯的错是什么？
说出来你可能不信，很多人连样品都放反了。
一排一排的八连管, 看上去都是相同的模样, 盖子上亦不存在标记, 不经意间手一滑, A排与B排就被弄混淆了。
发生了更为离谱的状况, 即使用了配有透明盖子的管子, 然而机器却无法识别荧光信号。
因而我的提议是, 再多花十元钱去购置有颜色的盖子用于覆盖, 或者在应用加样板之际要记着盖好并且压实。
此外, 添加完样品之后, 务必要进行离心操作。这一环节, 有许多人都将其省略掉了, 认为并无必要这样做。然而, 你需要明白的是, 如果管壁上的液滴没有被甩落下来, 那么反应体系就会呈现出不均匀的状态, 如此一来, 数据又怎么可能会好看呢?
8.
荧光定量PCR的未来会怎样？
说实话，这几年发展挺快的。
数字聚合酶链式反应已然能够达成绝对定量, 不再需要标准曲线了。另外存在那种微流控芯片, 其一回能够运行几百个反应。
然而, 荧光定量PCR在短时间之内并不会消逝不见。它具备价格便宜的特性, 拥有成熟这样的特质, 操作起来较为简易, 就大多数实验室而言, 依旧是性价比最为高深的一种选择。
就像有人问我，你还会继续用qPCR吗？
我讲可以呀, 只要它依旧能够给予我可靠的数据, 只要我还可以摸清楚它的脾性, 那么我们就始终搭档下去。
毕竟，了解一个工具的局限，才能用好它。
9.
临近结束时, 猛地忆起刚开始做实验的那段时候, 每一回运行qPCR, 内心都紧张得难以言表, 目不转睛地瞅着仪器屏幕, 注视着它数值一点点地往上升, 满心担忧曲线会中断。
现在虽然熟练了，但每次加样前还是会深呼吸一下。
存在不确定性的实验这种事物, 我们所能致力于达成的是, 将每一步骤都切实做到扎实稳固, 把每一个细微环节都精准地钻研透彻, 使其达到精细完备的程度。
数据不会骗人，但前提是——你得给它一个不骗你的机会。
