实验室做实验，最烦什么？
并非是样品处理存在极为繁杂的状况, 也不是数据无法得出结果来。最为令人厌烦的则是, 你分明是一步一步依照标准流程操作, 然而结果却是最后显色呈现出极其糟糕的状态, 背景深到犹如墨汁一般, 或者干脆就是没有信号。
你检查了一整天，最后发现是二抗选错了。
这事我干过。不止一次。
那个时候, 刚刚进入实验室之际, 导师扔了一本说明书给我, 讲“你去购买二抗”。我瞅了一眼, 全都是英文, 也没有太放在心上, 就照着其他人所买过的型号去下单了。结果, WB跑起来之后，背景居然比条带还要亮。
后来我才知道，二抗这东西，不是“随便买一个就行”的。
为什么说选二抗就像相亲
你仔细思索一下, 一抗可是你特意挑出来的, 耗费了那般多的心思, 去查阅文献, 向师兄请教, 查看评论。然而到了二抗这里, 随意选取一个, 这怎么能够行得通?
二抗和一抗之间必须得“门当户对”。
老鼠所制的一抗, 对应的二抗就得是抗鼠的, 兔子所制的一抗, 对应的二抗就得是抗兔的, 这听起来很简单吧, 然而我曾见有人将抗兔的二抗用于鼠源一抗上, 最终整张膜呈现出均匀的棕色, 什么都无法看出来。
除此之外, 二抗的标记形式同样关键。你所进行的实验是Western Blot, 亦或是免疫组化, 又或者是免疫荧光呢? 每一种实验所采用的二抗种类并不相同。
一般情况下, WB会采用HRP进行标记的二抗, 添加底物之后进行曝光操作, 从而出现条带。免疫组化通常会使用生物素进行标记, 并且还需要再配合链霉亲和素相关的那套系统。若是荧光的情况了, 那么就要搭配不同波长的荧光标记。
所以，别买错了。
你买的二抗跟你的实验对得上吗
这个问题很直接，但很多人忽视。
你手里的样本是什么物种？人？鼠？兔？鸡？
针对你所使用的一抗来源物种选用专门对应的二抗 此即为必须遵循的要求 倘若你运用兔源一抗展开对人样本进行检测的操作 那么所使用的二抗就必定得是抗兔类型的 情况就是如此简明扼要。
可是, 存在着更为精细的情况。举例来说, 倘若你的样本是老鼠, 并且一抗也是来源于老鼠的, 于那种情形下, 直接去使用抗鼠的二抗, 极易致使背景偏高, 原因在于老鼠的体内本来就存在着数量众多的IgG。在这个时候, 你或许就得思索采用具有更高特异性的二抗了, 比如说仅仅识别轻链或者仅仅识别重链的二抗。
还有个坑——二抗的交叉反应。
某些二抗厂商所生产的货物, 会跟别的物种的IgG产生交叉反应, 你明明做的是人的样本, 二抗却和牛血清当中的IgG结合在一起了, 背景随即就爆炸了。
挑选二抗之际, 最优选择是那种历经了交叉反应吸附处理的二抗, 尽管其价格相对较高一些, 然而却是值得的。
稀释比例怎么定？别信说明书
说明书上写的1:5000，那是建议，不是标准。
按照我自身的经验来讲, 要是你所进行的是ECL发光操作, 那么二抗的浓度能够适当地降低一些, 比例为1:10000甚至是1:20000的时候, 都能够呈现出很好的信号。要是浓度过高的话, 反倒背景会偏重。
但是, 假设你从事的是 DAB 显色工作, 那么, 稀释的比例或许得稍微浓上一些, 大概在 1:1000 至 1:2000 这个范围之内。
合适的具体数量究竟是多少, 这得依据你的实验体系以及一抗的质量来判断。最为理想的方式乃是去进行梯度稀释。不要嫌弃麻烦, 尝试一回, 后续能够节省半年的时间。
二抗的保存比你想的重要
很多人买了二抗回来，往冰箱里一扔就完了。
但二抗这东西，怕反复冻融。
通常买回来的皆是浓缩液, 使用之际将其分装入至小份之中, 加以-20℃进行保存。一回拿出一管来予以使用, 使用完毕便丢弃, 切勿反复冷冻。
还有个事儿要记住, 就是去加那个防腐剂。好多二抗原液当中间是含那叠氮钠的, 不过要是你的二抗它属于HRP标记的这种情况, 那就不能够去加叠氮钠, 因为加这个是会对酶活性起到抑制作用的。所以基于此, HRP标记的二抗通常来讲是得加那个甘油进行保存的, 并且要做到避免出现反复冻融这种状况。
若是没留意这些细微之处, 二抗的活性已然降低, 你却浑然不知, 反倒误以为是一抗存在问题, 就是这样。
品牌怎么选？国产还是进口
说实话，这个问题有点敏感，但我还是想说。
某些进口品牌的确具备稳定性, 就像杰克逊、赛默飞、CST这类, 尽管货期较长, 可是质量有着保证。其短处在于价格高昂, 并且在最近这两年, 供货的速度减缓了许多。
现当下, 国产品牌进步速度相当快, 部分做出来的效果甚至要比进口的还好, 其具备价格低廉的特性, 配送速度快, 售后响应也及时, 然而存在一个问题, 即不同批次之间或许会存在波动情况, 要是你开展的是长期重复性实验，那么建议一次性多购置几支, 预留足够数量属于同一个批次的。
不管选哪个，先看看别人的评价，尤其是同领域的。
最后说一句
选二抗这件事，说大不大，说小不小。
它并非斩钉截铁不容置疑般直接裁定你实验的成功或失败, 然而却绝对会对实验的效率企及特质产生显著影响。具备杰出品质的二抗, 能够促使你实验的最终成果呈现出清晰悦目毫无瑕疵状貌, 节省数量难以计数的反复操作所需的时间耗费。品质低劣的二抗, 会致使你陷入对自身及整个实验过程极度怀疑的境地。
所以，下次买二抗的时候，别光看价格。
多多深思你的所做实验的相关需求, 瞧瞧你手头的样本所属类型, 查一查你所选用二抗的对应的提供物种, 去尝试一下妥当的适合的稀释比例。
这点时间花得值。
毕竟，做实验已经很累了，别让二抗成为压垮你的最后一根稻草。
