说实在的, 当我头一回听闻“荧光定量PCR”这六个字之际, 我的脑袋里充斥的尽是问号。
我对那个能将极少量 DNA 放大至肉眼可见的类似于 “复印机” 的 PCR 大致有所了解, 可是在其前面加上 “荧光定量” 这一概念又是什么含义呢, 难道是意味着复制的时候还要同时发出闪光吗?
过了些时候, 在从事这一行业有了较长时间之后, 我才渐渐地品出了其中蕴含的意味。这个东西, 简单来讲, 实际上就是一个“复读机”, 然而它并非是对声音进行重复, 而是对基因进行重复。
它到底在“量”什么？
不少人觉得PCR就是检测“有没有”这种情况, 就像新冠检测那样, 呈现阳性意味着存在病毒, 呈现阴性意味着不存在病毒。然而荧光定量PCR并非如此, 它不但要向你说明“有没有”这种状况, 而且还要向你表明“有多少”这种情形。
你说这有啥用？
用途可大着。比如说, 你去探究某种基因在癌细胞当中是否格外活跃, 仅仅晓得“存在”是毫无用处的, 你必须明确它相较于正常细胞多出了多少倍数。是十倍吗? 又或者是一百倍? 这会直接判定这个基因究竟是不是关键靶点。
那个荧光是怎么回事？
说到底实际上蛮土气的。即在PCR的反应体系当中添加了些许荧光染料或者荧光探针。这些染料存在一个奇特习性: 其唯有跟双链DNA相结合之际才会发出光亮 , 处于游离状态时就是个不发声的。
聚合酶链式反应中, 每进行一轮扩增, 脱氧核糖核酸的数量便会增多一倍, 与之相应的荧光强度也就会增强一倍。而仪器设备着重关注着这一荧光信号呈现情况, 一轮一轮地对其进行记录。
照理论来讲, 当你进行30轮扩增之后, 荧光信号会比最初时亮出几个亿倍, 从几乎难以看见, 转变为亮到能把眼睛晃瞎, 而机器正是依靠这个从不存在到出现的过程, 逆推得出最初那管样品里究竟含有多少模板DNA。
为什么叫“实时”？
这台机器是实实在在全程盯着看的, 不是待反应全部结束才告知结果, 而是每进行一轮扩增, 就会“咔嚓”一下拍一张照片。
你试着去想象, 有一个细胞, 它分裂成了两个, 这两个又变成了四个, 四个进而变为八个, 如此这般不断变化……荧光定量PCR呢，它就是那个站在一旁数数的家伙。它可不只是数总数, 而且还会记下你是在什么时候开始呈现爆发式增长的。
这个“什么时候开始爆发”非常关键。
Ct值是个什么鬼？
Ct值，循环阈值。听起来很高端，其实就是个数字。
假定你开展PCR, 先前的10轮之中荧光信号全然没有任何动静, 直至第11轮忽而开始往上升高, 这个11, 也就是Ct值。
故而说道, Ct值越小, 表明样品之中原本的DNA数量越多。缘由在于, 不需要进行太多轮的扩增就能够检测到信号。
你去寻思寻思, 有一个样品的Ct值是15, 还有另一个样品的Ct值是30, 前面那个比后面这个不止多出了好几百倍呢。如此这般去思索一番, 好多事情就都变得清晰明白了。
绝对定量和相对定量，哪个更靠谱？
很多人一上来就问：我要做绝对定量。
看起来超厉害的绝对定量, 会直接告知“每微升样品当中存在3500个拷贝”。然而为了能够达成这一情况, 你必需先去做可以作为参照的标准曲线, 这就需要具备已知浓度的标准品, 并且标准品以及你打算进行测量的样品的扩增效率必须达到完全的一致才行。
难。
相对定量可要简单许多了, 我并不需要去知晓具体究竟有多少个拷贝, 我仅仅是想要弄清楚“处理组的这个基因表达量会是对照组的多少倍”, 炮制个内参基因, 构建个对照, 一番计算比值便能够得出结果了句号。
说实在的, 多数实验方面存在的疑问, 相对进行定量已然足以。你偏偏要执意求取那完全精准的定量, 有时反而像是做了徒然无益之事, 多余而麻烦。
熔解曲线是个什么鬼？
这个我一开始也搞不懂。
机器于PCR结束之后, 缓缓地进行升温操作, 升温的同时对荧光予以监测。DNA双链在高温状况下会出现解开的情况, 一旦出现此解开的情形, 荧光染料便会掉落下来, 信号也就随之消失了。
不同长度的DNA片段，解链温度是不一样的。
要是你的产物仅有一条带, 那么熔解曲线便是单一尖峰, 要是存在杂峰, 那就表明有非特异性扩增或者引物二聚体。
因而, 熔解曲线实际上就是那对PCR结果起着“质检员”作用的存在。表现不佳不符合要求的产物, 一概都要退回让其重新进行制作。
为什么有时候做不出来？
太常见了，常见到我都麻木了。
不能够做出来的缘由存在成千种, 引物于设计方面不尽乎合理, 模板在质量层面欠佳, 抑制剂的数量过多, 退火的温度并不正确, 甚至于在你进行加样之时手部出现了抖动一下此种状况。
进行荧光定量PCR时, 对于实验操作的要求是极其高的。倘若你在加样的时候, 差了那么零点几微升一下的量, 那么最终所得到的结果, 就极有可能差出好几倍之多。
因此现如今我形成了一种习惯, 那就是每逢开展荧光定量PCR的时候, 必定要去做三个复孔, 与此同时还必须得做出阴性对照来, 并非是出于想要炫耀技能的想法, 而是为了能够给自身所获取的数据留存下一条得以生存的途径来呢。
那个“天花板效应”
有一个很坑爹的事儿叫“天花板效应”。
当你的模板浓度处于特别高的状态时, PCR进行到后面阶段, 荧光信号却不再呈现增长态势, 原因在于染料用量不足, 或者底物已经被耗尽了。
这时候机器还以为你才刚开始呢，其实已经结束了。
所以, 好多才刚开始的新手, 在拿到结果之后, 留意一看, 表示稀奇, 咋个这几个孔的信号曲线呈现出平的状态？是未曾添加模板的缘故吗?
不，是你加太多了。
我觉得它像是个“基因称重机”
你去思考一下, 你手持着一管呈现浑浊状态且质地不清的液体, 凭借肉眼是根本没办法分辨出其中究竟含有多少DNA的。将其放置在普通的PCR仪上去运行一番, 如此一来, 也仅仅能够知晓是“有”或者是“没有”罢了。
但荧光定量PCR不一样。
其宛如一台极为超级灵敏的称重机器, 能够针对那微小到看不见且摸不着的基因片段, 为你“称”算出大致的重量。并且其所称之物不嫌数量少, 哪怕仅仅只有几十个拷贝, 它也能够为你检测出来。
那为什么大家还是怕做？
因为太麻烦了。
并非是机器存在诸多麻烦之处, 而是准备的整个过程相当麻烦。RNA必须提取得优质, 逆转录务必要操作得精良, 引物需要设计得精确, 加样必须添加得准确无误, 数据分析得运用正确的方法才行。
一步出错，满盘皆输。
而且那个机器还特别贵，坏了修一次够你吃半年土。
写在最后
不是什么超乎寻常难以理解的前沿高科技的荧光定量PCR, 它仅仅只是一个工具而已, 然而这个工具确实是非常奇妙的, 它能够使我们看到那些无法看见的变化。
当你瞅见屏幕之上那道荧光曲线自地平线徐缓升起, 愈发陡峭, 最终抵达顶峰。你内心实则颇为明晰: 那些肉眼无法瞧见的基因片段, 正于那个微小的试管里头疯狂复制。
于它们而言, 有人正注视着它们这一情况是全然不知的, 并且, 这些数据会被运用于撰写论文、开展诊断以及研发新药这件事, 它们同样是毫不知情的。
它们只是忠实地执行着自己的使命——复制，发光，被记录。
就像这台机器一样，沉默，精准，从不抱怨。
