说实话，干我们这行的，谁没被试剂盒坑过？
那种感受啊, 恰似你耗费三日三夜精心筹备起的实验, 于最终一步之际, 盒子却出现了状况。致使数据全然报废, 样本白白消耗, 老板投向你的眼神仿若能将你牢牢钉在墙壁之上。
我懂。真的懂。
专门用于小鼠的ELISA试剂盒, 看上去好像都没什么差别, 其包装皆是色彩斑斓的样子, 说明书有着厚厚的一叠, 所标注的参数更是被吹嘘得仿若天花乱坠一般。然而, 当真正开始实际操作上手的那一刹那间, 才会明白究竟什么才是“从书本上得来的知识, 毕竟是不够完善的”。
选盒子第一步，先看什么？
别急着看灵敏度。
有好多人一开始就马上询问“你这个试剂盒检测界限是多少”的情况, 似乎感觉灵敏度高便意味着全部。然而你仔细思索一下, 灵敏度与特异性向来一直都是相互对立的两方, 你却非要让这两者同时都达到满分的程度, 那岂不是做梦般不切实际的事情吗。
看什么呢？
看样本类型。血清？血浆？细胞上清？组织匀浆？
测血清的盒子，被拿去测组织匀浆, 那不同样本基质呈现出的差异太过巨大, 其结果就如同飘忽不定的股票一样, 到时候你能找谁来哭诉如此巨大且不合适的结果呢?
我曾遇见过一位师妹, 她因贪图价格便宜, 从而购买了一款通用型的小鼠 ELISA 试剂盒, 然而她所使用的样本却是脑脊液, 最终那数据呈现出来的样子, 简直就如同心电图一般。
标曲，才是试剂盒的灵魂
啊对，标曲。
这个东西，说多了都是泪。
有的试剂盒, 其标曲呈现出宛如教科书里插图那般美的状态, 此时R²的值为0.999 , 这种情况下你看了便会萌生出想要下单的想法。然而当它到了你手上, 经过自己亲自跑一遍之后, R²的值却直接下降到0.85。
为什么？
因厂家所给的标曲乃是处于“理想状态”之下的, 此“理想状态”包含超纯水、完美操作以及恒温恒湿这些条件。而你实验室中的那个破旧的 37℃培养箱, 两者能是一样的状况吗?
故而, 切莫仅仅盯着厂家所给予的标曲图, 你应该向他们索要“实操标曲”, 或者干脆让他们给出三批由各异操作人员跑出来的数据。
如果他们支支吾吾给不出来……
你懂的，赶紧换一家。
抗体对，这个坑你踩过吗？
夹心法ELISA，说白了就是靠抗体对干活。
一个包被，一个检测。
听起来简单？但这两只抗体要是闹别扭，你的实验就完蛋。
我存在一位朋友, 在前些时候购买过某个著名品牌的小鼠 TNF-α 试剂盒, 然而最终跑出来的背景高到了难以置信的程度, 无论怎样去清洗都根本无法将其洗去。后来经过一番查询, 发现是包被抗体跟检测抗体之间出现了非特异性结合这种情况。
你说气不气？
这种问题，说明书上不会写。你只能靠问。
向经销商询问: 此抗体针对什么做了验证? 是否开展过交叉反应实验? 与同家族的其他因子有无干扰?
别嫌麻烦。你问得越细，踩坑越少。
酶标仪，别让它拖后腿
这件事说出来你可能不信。
存在这样的情况, 有人购置了一款处于最高配置层级的小鼠ELISA试剂盒, 然而, 在进行读数操作的那个时候, 却发觉酶标仪所具备的波长并不准确。
450nm的检测波长，他的机器偏到了455nm。
差5nm，结果能差20%以上。
这不是试剂盒的错，是你设备的锅。
所以做实验之前，先校准你的酶标仪。
别省这个钱。你省了，数据就会给你颜色看。
关于稀释，多说两句
很多新手一上来就按说明书稀释样本。
但你知道吗？说明书上的稀释倍数，很多时候只是个“建议”。
你所饲养的小鼠, 你采用的处理方式, 你进行的样本保存条件, 与说明书里所提及的“标准操作”, 能够是一样的吗?
不一样。
所以预实验是必须的。
先是执行一次梯度稀释操作, 接着查看其OD值究竟处于标曲的哪一个范围之内。要是该值过高, 则进行稀释举动, 若是偏低就莫要进行稀释了。
这道理听着简单，但真这么做的人，十个里面不到三个。
剩下的七个，都在补实验。
保存条件，被严重低估
试剂盒买回来，4℃保存还是-20℃保存？
这里面门道可多了。
存在一些试剂盒, 其抗体对在4℃的环境温度之下, 仅仅能够保持稳定一个月的时间, 而在-20℃环境温度时, 能够稳定半年, 要是你没有加以留意, 所购买到的是临近效期的库存, 那么结果是可以想象得到的。
还有那个洗涤液。
那经过浓缩制成的洗涤液, 在低温的状况下极易出现结晶的现象, 在使用之前务必要进行充分的回温操作。有好多人偷懒, 直接就把它倒进去了, 后来结果是盐析出来了, 进而堵住了洗板机。
然后板子洗不干净，背景高，数据废。
你说冤不冤？
冤。但这就是实验。
怎么判断试剂盒好不好用
别只看品牌。
大品牌也有坑货，小厂家也有良心产品。
关键看什么？
看重复性。同一批次内、不同批次间，CV值稳不稳定。
看回收的比率, 加上标准后的回收比率处于百分之八十五到百分之一百一十五之间, 这样算是合格, 比这个范畴要低, 你的数据就是不可靠的。
看线性。稀释后的样本，线性好不好。
这三项指标, 质量好的试剂盒说明书当中是会有所记载的。若没有记载, 你就向他们去索要。要是索要不到, 那就直接拉黑。
我见识过极为离谱的情况, 有一个声称是进口分装的小鼠IL - 6试剂盒, 该试剂盒不同批次之间的CV数值竟然高达25%。
这还能用？你猜猜是谁家的，算了不说了，怕被骂。
最后说点真话
市面上小鼠ELISA试剂盒太多了。
多到让人眼花缭乱。
但好用的、数据稳定的，就那么几家。
某些厂家, 明明只是个规模较小的手工作坊, 却非要将自身包装成具有国际影响力的知名大牌。其说明书印制得色彩斑斓、繁杂花哨, 产品参数撰写得夸张至极、不着边际, 然而一旦实际使用, 所有问题便全部暴露无遗。
所以呢？
别信广告，信数据。
别信宣传，信实测。
买之前，要一份试用装，自己做一遍。
你自己跑出来的结果，比任何宣传都靠谱。
如果厂家连试用装都不给……
呵呵，你自己品吧。
做实验不容易，别让试剂盒成为压垮你的那根稻草。
