你可曾有过这般时刻, 盯着电脑屏幕之上的那条扩增曲线, 心里陡然间泛起一阵莫名的发毛之感, 暗自思忖, 如此这般的这一玩意儿究竟是否准确无误, 进而又心生疑虑, 自己所做出来的这些众多数据, 到底能不能够予以信任?
反正我有过。
而且不止一次。
荧光定量PCR此物, 简单倒是简单得很, 复杂亦是复杂得很。简单至极, 就连实习生都尚可上手予以操作, 复杂之极, 纵你已然做了三五年之久, 依旧会一不小心就踏入陷阱。那样种种陷阱, 恰似安埋于实验台下方的地雷一般, 根本无从知晓何时便轰然爆炸了。
为什么同一样品，两次结果差那么多？
你肯定遇到过。
同样的一个样品, 上午进行了一回操作, 下午又开展了一回, Ct值出现了相差一两个的状况。你开始心生疑虑, 自己究竟是不是手部发生了颤抖, 又或者是加样的时候出现了差错。随后你决定对所有能够实施检查的事物予以检查, 其中包括试剂, 包括耗材, 还包括仪器的设置, 然而全部都没有问题。
但你漏了一个事儿。
温度。
可不是PCR仪的温度那儿, 而是实验室这边的温度, 夏天的时候开启空调, 冬天的时候打开暖气, 你所处的加样环境温度存在着好几度的差别, 就只是这几分的度数, 能够造成你的反应体系当中出现肉眼没办法看见的冷凝水, 进而影响到加样的精度, 你自认为加进去的是1微升, 实际上却仅仅只有0.8。
这事儿吧，说明书上一个字都没写，但你实操久了就会发现。
引物设计是不是越完美越好？
说真的，很多人把引物设计当成玄学。
他们耗费大量时间去叠那个Tm值, 叠到了小数点之后的一位, 那程度简直就是特别渴望两条引物之间的Tm差值达不到0.1度。随后就自以为是地感觉自己的设计相当完美了, 可以说是完美至极到不行这般的地步。
但实际上呢？
你做出来的曲线照样乱七八糟。
说到引物这个东西, 即便在纸上计算得再怎么精妙绝伦, 可终究都比不上真正拿到上机去跑上那么一回。你所处实验室的条件如何, 你所拥有的模板纯度究竟怎样, 还有你所使用的聚合酶活性水平怎样, 这些都会对最终呈现的结果产生影响的。可千万别将时间白白浪费在对那零点几度极为细微的Tm值进行一些细致入微的调整上面, 倒不如多去验证几对等待筛选的候选引物。
内参基因到底选哪个？别跟着论文瞎学
众多的人开启文献, 瞧见他人运用GAPDH, 己方随之也运用GAPDH。看到别人采用β - actin, 自身同样采用β - actin。
但是, 你可了解, 你从事钻研的那个组织, 以及那个所置于的处理条件, 对于GAPDH的表达来讲, 极有可能从根本上就不存在稳定性。
某个人, 他研究某种药物对小鼠肝脏所产生的影响, 选用GAPDH做起内参考物。事后结果展现是, 药物处理一组跟对照组相比, GAPDH的表达量相差接近两倍。此人将此表现视为药物处理带来的成效, 兴奋异常。可随后发现, 这仅仅是药物对GAPDH的表达造成了影响，这关联与他的目标基因毫无关联。
惨不惨？
惨。
然而, 此情况常常出现。要做的事情乃是, 先去查验几个候选内参于你自身体系之中的稳定程度, 寻觅最为稳定的那一个。
标准曲线的斜率怎么看？别只看R²
很多人做标准曲线，就盯着R²看。0.99以上就觉得完美。
但R²只告诉你线性关系好不好，它不告诉你扩增效率高不高。
扩增效率要看斜率。
理想状态下的斜率呈现为-3.32 , 其所对应的情形是具备100%的扩增效率。你所拥有的斜率要是为-3.8 , 那么效率仅是80%多 , 按照如此情形计算得出的绝对定量结果 , 偏差能够大到令人感到十分惊悚。
每个反应做三个复孔够不够？
你制备一个样品时要做出三个重复的孔, 将其均匀分布一下, 进而计算得出一个平均数值。然而你是否时时刻刻都留意到, 这三个重复的孔相互之间的差异究竟会有多么大呢?
如果差异很小，比如Ct值标准差不到0.1，那三个复孔够了。
但如果差异大到0.3甚至0.5以上呢？
你若是做三个复孔, 这般便没什么意义了。你理应去做五个, 甚至六个, 借此将这个差异如实地反映出来。而后思索一番, 为何同一个样品会出现这么大的差异, 是加样时精度欠缺吗? 是模板呈现不均匀的状况吗? 又或者是反应体系存在问题呢?
别省那几个孔的钱。数据错了，重做花的钱和时间更多。
熔解曲线里的小峰，你当没看见？
好多人在完成了扩增之后, 瞅了瞅熔解曲线, 嗯呐, 发现主峰蛮高的, 至于后面的小峰，就当做没瞧见。
但那个小峰在告诉你一件事：你的PCR里有非特异性扩增。
也许是引物二聚体出现了, 也许是非特异性产物存在着。不论究竟是什么, 它都在对你的定量结果造成干扰。你的荧光信号并非仅仅源于目标产物, 还有这些形形色色的事物所贡献的。
你说，那怎么办？
把引物重新进行设计, 或者将退火温度予以优化, 又或者去更换更为出色的聚合酶。休想装作没瞧见。
说个更扎心的
你辛辛苦苦做出来的数据，可能从第一步就已经错了。
许多人在进行RNA提取这一环节时, 做得都流于表面、敷衍了事。就算纯度不足也并无大碍, 差不多浓度的就可以了。然而你所不晓得的是, 残留在RNA当中的那些有机溶剂, 会对下游的反转录产生抑制作用且会抑制PCR反应。
你觉得是模板数量不足, 实际上是受到了抑制, 你补充更多的模板, 抑制的情形会更严重。
这事儿特别的讽刺。
还有那个稀释样品的问题
有时, 你的样品Ct值过大, 像36以及37这样, 你认为不行, 必须重新去做。
但你有没有试过把样品稀释一下再做？
听起来违背直观感受对吧, Ct值越大意味着模板数量越少, 然而你却反倒要去对其进行稀释么?
可是偶尔呢, 样品当中存在着抑制物, 将其稀释一番后, 抑制物的浓度随之下降, 反倒得以跑出正常的曲线。
这事儿我试过，真的有效。
最后说点真心话
具备荧光定量功能的PCR这种技术, 看上去尤为成熟, 格外简单。然而, 越是看上去简单的事物, 越易于在细节方面出现问题。
一旦你做的时间略微长些, 你便会发觉, 此项技术所考验的事并非是你的实验技法, 而是你的耐心同直觉。
你要学会分辨，哪个信号是真实的，哪个信号是假象。
当数据并非处于完美状态之际, 你务必要学会去判别它, 究竟是能够加以运用的, 还是绝对需要重新去做的。
这些能力，说明书上没有，培训课上也不教。
只能靠你做，做，再做。
然后在某一天，你突然就懂了。
