说实话, 当首次听闻“荧光定量PCR”这个词汇的时候, 我的脑袋瓜里尽是些疑问的符号。
什么是PCR? 荧光能干什么? 为何进行定量? 这东西跟我有什么关联?
别急，我当初也是这么懵过来的。
后来硬着头皮查了一堆资料，发现这东西其实没那么玄乎。
说白了，它就是一台特别灵敏的“基因放大镜”。
来思考一下, 要是我打算于茫茫人海之中寻觅到某一个人, 不过此人身材极小, 我压根就瞧不见。将要如何处置呢? 我能够为其穿上醒目的荧光服, 接着再用以高倍望远镜。荧光定量PCR所做之事正是如此这般的。
使得一段特定的 DNA 穿上荧光服, 接着在机器当中自行复制, 一次复制之后又进行重复复制, 再次复制之后还持续复制。
每当进行一次复制操作, 荧光便会亮上些许。那台机器始终注视着这个荧光, 目睹着它由微弱逐渐变得刺眼。
它到底怎么数数的？
这事儿最神奇的地方在于——它不光能看到，还能数。
你可能会想，它怎么数？难道像数豆子一样，一颗一颗点？
当然不是。
它用的是“实时监控”这套路。
开头的时候, 样本之中所含有的目标DNA或许仅仅只有几百个拷贝, 即便是使用显微镜也无法观察出来。然而机器却毫无顾忌, 它着手开始“催熟”这些DNA, 致使它们以指数级别的速度翻倍增长。
翻一倍，荧光亮一点；翻两倍，再亮一点。
机器在旁边进行记录, 记录从“开始”起, 直至“荧光明显亮起来”, 所需的循环数目是多少。
你能猜到会怎样吗? 这个“重复循环呈现特定规律的数”直接对原始样本之中究竟存有多少目标脱氧核糖核酸起到了决定性作用。
循环数倘若越小, 那就表明原始样本之中目标是越多的, 这是由于很快它就会亮起来的缘故呢 ；循环数要是越大, 那就意味着原始样本里面目标是越少的, 需要慢慢去孵才行。
难道不是隐约有点相似于你去追一部剧集, 在其第一集的时候就瞬间爆发出热度, 以及一直播放到第八集此剧才开始有人去观看——这般感觉可绝对是全然不一样的哟。
为什么不是普通PCR？
有人肯定要问：以前不就有PCR吗？那个不也能放大DNA？
对，普通PCR也行。
但它是“定时炸弹”，不是“智能炸弹”。
普通PCR的做法是, 设定一个固定的循环数, 比如说35个循环, 然后直接去看结果, 有, 即为有, 没有, 即为没有, 它不会告知你最初有多少, 仅仅说“有”或者“没有”。
情形恰似你这般询问“今晚吃饭了吗? ”, 如此一来, 人家所能给出的回应便仅能是“吃了”, 或者是“没吃”。
然而荧光定量PCR并非如此, 它不光能够表明“吃了”这种情况, 而且甚至还可以向你告知到底是“吃了一碗”这种状况 , 还是在说“吃了三碗”这种情形。
这信息量，完全不是一个级别的。
现实里的场景
你可能觉得，这技术离我很远吧？
其实不是。
考量一下食物检测, 我存在一位于食品厂就职的朋友, 他们每日都得针对原料展开检测, 查看其中是否含有某些特定成分, 像是转基因成分。
怎么测？就是用荧光定量PCR。
他们选取了少之又少的一点点大豆，从中提取出了DNA, 而后将其放置到一台机器当中。过去了几个小时之后, 最终的有关结果便呈现出来了。
要是存在, 荧光曲线便会出现上升的情况；要是不存在, 那就会始终保持为平的状态。这种方式简单直接又不加修饰, 然而精准得极其厉害。
另有一场景被称作环境监测, 像检测水里特定细菌的浓度, 又或者检测土壤里微生物的多样性, 以往依靠培养, 待菌落生长出来之后再去计数, 速度快的情况下需要两三日的时间, 速度慢时会耗费一周的时长。
现在呢？几个小时后就能知道数量。
时间就是金钱啊，老铁们。
它真的那么完美？
说实话，也不是。
它确实灵敏，但太灵敏了就容易出问题。
比如说, 当你进行操作之际, 手部出现了抖动现象, 这时外界极其微小的一丁点DNA飞了进去, 随后, 结果就变得失真了, 假阳性便是如此产生的。
因此, 从事这个实验的人员, 全部如同进行手术那般, 需要身着白大褂, 佩戴手套, 喷洒酒精, 更换鞋子。
就为了让实验室里没有一丁点外来的DNA。
还有，它只能检测你“想找”的东西。
具体是什么意思呢, 那便是你必须要预先清楚你所要找寻的是哪一段基因, 接着去设计与之相对应的探针以及引物。它并非会如同侦探那般毫无目标地去寻找, 而是恰似一只警犬, 仅仅追踪已指定好的气味。
你没让它找的，它就看不见。
这便显示出了局限性, 举例来说, 倘若你期望去查看样本当中存在何种未知的病原体, 采用荧光定量PCR这种方式是行不通的, 你必须运用更为高级的技术手段, 像是高通量测序才可以。
小提示：你做实验前一定要注意
我踩过坑，所以要说给你听。
样本质量一定要好。DNA降解了，全都白搭。
设计引物, 以及设计探针, 这件事情是需要做到靠谱的, 不可以随意找一款软件进行设计之后就当作事情完成了的, 最好能够运用专业相关的事物用来验证一下。
每个样本都要做三个复孔。别嫌麻烦，这是为了排除偶然误差。
务必要去做阴性对照以及阳性对照才可以。要是没有对照的话, 你根本就没办法知晓结果究竟靠不靠谱。
就曾有过一回, 只因贪图省事, 仅仅做了一个复孔, 结果呈现出一条怪异的曲线。过后补做了三个, 却发现是受到了污染。那次所涉及的科研数据, 全部都作废了。内心痛苦到了难以呼吸的地步。
所以，该花的功夫，真的一分都不能省。
写在最后
荧光定量PCR不是什么遥不可及的黑科技。
它就是一个工具，一个帮你“看见”并“数清”DNA的工具。
在你理解了荧光信号, 以及实时监控, 还有循环数, 这些它的原理之后, 你便不会再觉得它神秘了。
仿佛你去学骑着自行车, 才开始的时候认为平衡难点, 然而一旦掌握了, 它便成为你的腿。
这技术也是这样，了解了它，你就多了一双金色的眼睛。
看东西更清楚，更定量，更准确。
这就够了。
