养了三年原代细胞，说句实话，我到现在还是经常翻车。
真的, 这东西娇气到了极点。毫不夸张地讲, 它比养多肉可难上一百倍。像如果养多肉, 即便一个月不给它浇水, 它依旧能够存活, 然而对于原代细胞而言, 只要你稍微有那么一点点分心不留意, 它就会立马死去给你看。
当我处于第一年进行饲养期间, 那状态简直是满心怀疑自己是不是与细胞相互抵触冲突。明明更换培养基的频率足够勤快, 对操作台进行了三次消毒处理, 就连呼吸时都不敢发出较大声响, 然而最终结果又是怎样的呢? 仅仅三天时间, 最多不超过三天, 细胞便开始出现飘浮现象, 紧接着就逐渐变成圆形, 随后便彻底消失不见。
后来才明白一个道理——
是不是培养基选错了
你清楚不, 原代细胞跟传代细胞系可不是同一回事, 传代细胞系如同街边流浪猫, 给些食物便能存活, 脏水也会饮用, 那原代细胞如何呢, 它好似人家悉心饲养的金毛, 你得为其准备专门配制的狗粮, 水温必得37度, 碗还得是陶瓷的。
诸多的人, 直接将DMEM以及10%胎牛血清径直地往里添加。他们告知我, “大伙都是如此运用的”。然而, 关键在于, 原代细胞这般事物特异性极为强烈。肝细胞具备自身的培养基配方, 神经元更是另外一套样子, 你秉持用以培养肿瘤细胞的模式去处理原代, 那无疑只有死路一条。
曾经有一回, 我对某进口品牌专有的培养基进行了更换, 随后细胞的状态一下子变好了, 我差点就哭了出来, 原来并非是我操作失误, 而是之前没有给它提供适宜的东西。
消化那步是不是太狠了
胰酶这东西，我跟它有仇。
才开始去养原代细胞之际, 我的心头泛起特别害怕没法将其完善消化掉的忧虑, 老是感觉尚未把相关元素消化得干干净净, 从而增添了一些用于维持消化状态的时间, 一次又一次如此这般将时间拉长, 随后细胞处于消逝的状态, 乃是被消化这一行为致使其陷入消逝之境的。
之后, 有前辈跟我这样讲, 你瞧着细胞的边缘开始呈现出卷起来的态势时就停止操作, 别等到细胞全部都变成圆形之后再去终止, 因为一旦到了那个时候那就已经晚。
但是问题在于, 原代细胞的批次之间差异实在是太大了, 举个例子来说同属于肝细胞, 这一批次的细胞进行消化的时候三分钟或许就充足了, 另一批次的话可能就需要五分钟才行, 你始终都无法找寻到一个固定不变的标准时间, 所以完全依赖人手的感觉。
这手感，该咋讲, 那非得是亲自弄死几十只老鼠, 然后还得浪费几十瓶培养基 , 如此这般之后才能够建立起来的。不存在别的法子。
离心机是不是开太猛了
这个坑我踩了两年才发现。
原代细胞的脆弱状况, 是要高于你所想象的程度的, 当你将它从组织之中提取出来的时候, 它已然遭受了极大的创伤, 而后续, 你又运用离心机以3000转的速度对其进行五分钟的轰转操作, 最终致使细胞膜破碎瓦解。
有一位从事神经元研究的教师跟我讲, 他在进行离心原代神经元操作的时候, 从来都不会超过1000转, 转速上升的时候要缓缓地, 停止的时候同样也要缓缓地。他表示细胞也是具备尊严的, 要是你那么极其冲动地去甩它, 它到底能不能感觉舒适呢?
我当时觉得他在扯淡。
后来我试了一下，果然，细胞活率从60%直接飙到85%。
我离心原代细胞, 从那以后都采用水平转子, 加速时缓缓进行, 减速时同样缓缓而行, 恰似耐心哄小孩入眠那般。
污染的问题到底怎么办
这个我真的不想多说，但必须说。
原代细胞极易被污染, 缘由于你的组织来源自身并非无菌状态, 举例来说小鼠的肠道, 即便你用大量抗生素冲洗, 其中依旧存在物质。你在进行原代培养的头三天, 基本上就是在与杂菌展开赛跑。
我曾尝试将双抗添加至常规浓度的两倍, 然而结果却是细胞自身首先承受不住了。随后改为先用高浓度的抗生素去清洗组织, 而在培养时反倒是降低了浓度。
曾有一回是真菌致使的污染, 使得整个培养箱毫无作用了。自那之后我形成了一种习惯, 每次在开启培养箱以前, 先用酒精擦拭一遍手, 一直擦到皮肤呈现出发白的状态才停止。
实验室的人说我强迫症。
他们没有亲身体遭遇一种全然的绝望, 那种绝望是, 你用尽十二万分精心与劳苦养殖了十四天的原代细胞, 在一个夜晚的时间里, 全部都长出了毛发。
是不是传代太晚了
初代细胞和传代细胞存在不同, 其不会持续不断地进行增殖。传代细胞经过一段时间的培养, 便会演变成细胞系, 此时已不再是初代细胞了。
在体外的原代细胞是存在寿命的, 通常传个三四代便会开始老化, 形态会发生改变, 功能同样会发生改变, 要是你还想要让它维持原来的状态, 那就得于它最为年轻力壮之际去做实验。
有些人老是觉得, “再饲养两天, 等其生长到那种程度之后再说”。那么当等到它们生长到那种尺寸并且长满之后, 细胞也已然开始进行分化了, 甚至已经开始走向凋亡了。随后你再去开展功能实验, 所获取的那些数据根本就没有办法去使用。
我曾有过这般差错, 在开展western blot之前, 等待着细胞生长得稍微多一些, 然而, 蛋白质表达量却始终无法重复先前的结果, 就这样白白耗费了两个月的时间, 此事真是令人懊恼不已啊！
养它的意义到底在哪
说实话，有时候我也在怀疑。
把原代细胞养了下来, 麻烦得很。成功率低得可怜, 成本高得离谱。为啥不直接去用细胞系? 那多方便, 稳定得, 数据重复性相当好。
但每一回我获取到一批状态极为良好的原代细胞, 当在显微镜之下瞧见那些形状完整的细胞时, 它们牢牢地贴附在壁上, 具有相当不错的折光性, 甚至能够瞅见细胞核里面的核仁, 就在那个刹那间, 你会产生这样的感觉, 即所有的种种折腾都是分外值得的。
由于你清楚, 那些细胞是才从活体组织之中取出来的，它们依旧留存着体内的多数特性呵。你所做出的数据, 在一定程度上更趋近于真实的生理状态呢。
发文章的时候，审稿人也吃这套。
于那些顶级期刊而言, 原代细胞的数据, 其含金量相较于细胞系确实更高。即使你所拥有的样本量相对少些, 同时数据波动幅度较大, 然而只要你表明“这是原代细胞”, 那么审稿人的容忍程度便会高出许多。
这大概就是为什么我们这帮人还在死磕原代。
因为你知道，真正好的东西都不好养。
