做实验的人都知道，等PCR跑完的那个下午，简直像在熬鹰。
扩增三小时, 再加上电泳, 之后等待胶图出来, 一天就过去了呢。要是遇到样品数量多, 或者引物较为挑剔, 又或者老板催促加紧, 那种焦虑的感觉呀 , 啧啧 , 只有在实验室里的人才能明白。
说实在的, 市面上那般被称作“快速”的试剂盒, 我尝试过好多。有的的确速度快, 然而扩增效率却很低, 条带如同鬼影一般。有的宣称半小时便能完成, 可结果是，非特异性条带比目标条带还要亮。还有的……算了, 不说了。
为什么PCR扩增总是不够快
此问题实际上蛮复杂的, 酶的活性, 缓冲液的配方, 热循环的升降温速率, 每一环节都兴许变成瓶颈。
不过许多实验室所运用的依旧是常规的Taq酶, 其延伸的速度每一秒仅仅是几十个碱基。你来琢磨一下, 要是想要扩增一个2kb的片段, 在72°C这一步骤就必须得等待一分多钟。经过三十个循环之后, 单单是延伸这一过程就得耗费接近一个小时。
另外, 许多人把热盖温度与体系优化之间的配合给忽视了。并非是讲把温度设定得高些、时间缩短些便能够快。太快的话, 酶就跟不上节奏；太慢的话, 又会白白耗费精力。
快速PCR扩增试剂盒到底靠谱吗
这话问得挺实在的。
我负责任地说——靠谱，但有前提。
倘若你的模板质量并非差到难以接受, 引物设计也没有太过离谱, 这是前提。再好的试剂盒也难以承受人为失误带来的影响。然而, 只要你操作符合规范, 这类试剂盒确实能够将PCR时间缩短至四十分钟以内, 有些甚至在半小时出头就能够完成。
关键在哪？在酶。
用于快速PCR的聚合酶, 皆是经过工程化改造的, 其延伸速度可达普通Taq的五六倍, 而且它们对热稳定性有着更高要求, 能够承受更短时间的变性步骤, 简言之, 就是要让酶在更短时间内完成更多工作。
用了快速试剂盒，条带会变淡吗
这个担心很正常。
不少人初次运用快速试剂盒时, 则恐惧的是, 速度固然快, 然而结果信号却消失了。
其实吧，这取决于你怎么调。
便捷快速的试剂盒所附带的说明书之上通常会给出降低循环数目的建议, 然而好多人并不安心, 依旧依照三十五个循环去进行操作。最终的情况是怎样的呢? 经过此操作后产物数量过多, 反而更加容易出现并非特异性的扩增现象或者出现拖尾问题。
真实的做法为: 起初尝试二十八至三十个循环, 要是条带亮度欠缺, 接着迟缓加码呈上。你能够发觉, 众多情形里三十个循环产出的后果, 较常规试剂盒三十五个循环更为明亮。
怎么选快速PCR扩增试剂盒
市面上的牌子太多了。进口的、国产的，各有各的说法。
就我自身所拥有的经验而言, 不要仅仅去关注价格, 同时也不要盲目地迷信进口这一行为。
价格昂贵的物品不一定就与你的体系相契合, 那些价格较为便宜的物品也并非就不好。关键之处在于得去查看这几个指标。
延伸的速率: 所标记的是每kb对应多少秒 , 在未充足到达15秒每/kb的时候 , 大致还算得上是合格的。
假如存在这样一种需求, 它是要将其用以实现克隆的操作, 又或者是进行测序的工作, 这时就必须去挑选具备校正功能的那种, 这就是所谓的保真度。
关乎兼容性方面, 存在这样的情况, 即部分试剂盒呢, 于那些GC含量较高的模板而言, 表现出格外的友好态势。
一个笨办法
我刚开始用快速试剂盒的时候，也踩过不少坑。
嗣后, 养成了一个习惯, 每次换上新盒子时, 会先进行梯度摸索, 并非依照说明书一开始就实行标准化操作, 而是将延伸时间、退火温度、循环数都设置几个梯度, 先行摸索一番。
听着好像麻烦, 然而仅仅就多耗费两个或者三个小时, 往后能够节省下来多少时间呢? 算一算账便清楚了。
那你仔细去思索一下, 实施一回PCR能够节省掉一个半小时, 一天之中开展五六个实验, 这便是七八个小时。一个月过去之后, 那会多出多少时间来用以查阅文献、撰写论文, 甚至……发发呆罢。
真正的问题不在快
说了这么多，其实我更想说的是——
PCR的扩增速率高不高呀, 试剂盒仅仅是一种工具罢了。切实使得实验进程加速的因素, 是你对于体系所具备的理解, 是你针对细节所进行的精准把握, 以及那种当出现问题时能够迅速加以排查故障的经验。
快速PCR扩增试剂盒的确是具备效用的, 然而它并非那种神奇的法术, 它仅仅是一种能够促使你将时间投放于更为关键事务之上的方式。
不要去期望仅仅一盒试剂便能将所有问题都给解决掉。然而要是你挑选得恰当、运用得恰当, 那它的确可以使得你的实验节奏明显加快许多。
少等几次PCR，多做几个实验。这才是正经事。
