ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。ELISA实验结果出现异常剖析：
一、白板异常：显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。
1. 试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用；
解决方式：检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。
2. 错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B；
解决方式：严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。
3. 洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力；
解决方式：确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。
4. 终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制；
解决方式：每次配制时都应看清标签标明物质。
5. 蒸馏水有问题；
解决方式：确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。
6. 显色弱、灵敏度低。
解决方式：实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。
二、阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。
1. 未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出。
解决方式：质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于 2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。
2. 质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出。
解决方式：重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。
3. 仪器设定不正确，滤光片不匹配。
解决方式：重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。
三、实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但标本感觉显色较弱。
1. 待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的。
解决方式：如有怀疑，可复检。
2. 标本加入叠氮钠作为防腐剂。
解决方式：酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂。
PCR反应在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术，其特点是可以以微量的DNA为模板，快速扩增得到大量拷贝。
一、PCR反应条件的控制：
1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反应温度
（1）变性温度和时间95℃，30 s。
（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
二、PCR的循环参数：
1. 预变性（Initial denaturation）
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。
5. 循环数
大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
关注手机微站
服务号
微信小程序
