我真的太烦了。
那种感受你绝对明白, 进行了许久的荧光定量PCR后, 最终跑完时去查看曲线, 瞬间心态崩塌。出现了未扩增情况, 熔解曲线杂乱无章, 重复孔之间的Ct值相差了好多, 随后你便开始对试剂产生怀疑, 对机器产生怀疑, 对自己是不是手出现抖动也产生怀疑。
我做了六年荧光定量PCR，翻过无数车。
随后发觉, 好多问题压根并非运气, 而是一些格外微小的细节。你略微留意一番, 结果便能够从“糟糕”转变为“稳妥”。
模板浓度到底多少才合适？
很多人喜欢把模板加很多，觉得“多一点肯定更亮”。
错了。兄弟，错了。
荧光定量聚合酶链式反应绝非普通聚合酶链式反应, 其所需模板数量并非那么多。若模板数量过多, 反倒会对反应起到抑制作用。特别是在诸如粪便、土壤、血液等诸如此类的一些复杂样本之中, 其中的杂质会伴随一同进入, 抑制效果更为显著。
我通常将其控制于10至100纳克的范围之内, 要是属于互补脱氧核糖核酸, 那就进行5至10倍的稀释之后再予以使用, 不要心存吝惜, 因为稀释过后的结果常常会更为美观。
曾经有一次, 我开展了一项对比实验, 样本是同一批的, 其中一部分直接使用, 另一部分进行了5倍的稀释处理, 然而, 稀释之后的Ct值却出乎意料地提前了1.5个循环数值, 况且其重复性表现得极为出色。
当时我就知道，贪多嚼不烂。
引物设计是不是在敷衍自己？
这个我真的要说。
诸多的人, 从文献之中搜罗出一个引物序列便加以运用, 又或者是让公司随意地去设计出一个, 到头来却行不通, 进行之后跑来询问我缘由何在。
为什么？你自己心里没点数吗？
荧光定量PCR针对引物的要求, 相较于普通PCR而言, 要高出许多, GC含量需处于40%至60%的范围, Tm值最好在58度至62度这个区间之内, 同时3‘端请勿存在过多的G/C, 以此来防止形成二聚体以及发卡结构。
还有，产物长度最好80-150 bp。
别太长，太长扩增效率就不行了。
有一回, 我记得, 一个朋友跟我讲, 他的扩增效率仅仅只有百分之七十五, 怎么都提不上去。我让他把引物发给我瞧瞧, 一查看, 产物长度是二百八十碱基对。换了一对引物, 效率一下子就到了百分之九十五。
你说这是不是自己坑自己？
为什么要做标准曲线？别偷懒
很多人觉得标准曲线是“学术要求”，跟实际实验没什么关系。
有关系。关系很大。
能通过标准曲线告诉你两件事情: 扩增效率是否可行, 以及你的体系是否稳定。效率处于90%至110%之间才被视为合格, R²要大于0.99。若达不到这个标准, 你所做出的Ct值是没有意义的, 定量结果也是靠不住的。
平均而言, 每一批次的实验我都会携带一条标准曲线, 就算仅仅是进行几个样本的测试, 也会如此。请不要厌烦这样做会带来麻烦, 因为这能够帮助你在后续避免无数次的重新返工操作, 重新去做一遍实验。
有一回, 我体系弄混了, 标准曲线一跑, 效率仅有60%。立刻发觉问题, 重新配制试剂, 再次进行操作。要是没有这条标准曲线, 我或许就对着那批错误的数据分析许久, 随后得出一个全然错误的结论。
你说哪个更浪费时间？
选染料这回事，真没你想的那么随便
SYBR Green还是TaqMan？
这问题我被人问过无数次。
廉价的 SYBR Green, 便利的 SYBR Green, 能够扩增任何基因的 SYBR Green, 不足在于其非特异性结合同样会生成信号。故而, 熔解曲线务必查看, 不查看就等同于白忙活一场。
TaqMan探针具有特异性程度高的特点, 其信号呈现出干净的状态, 然而价格昂贵。并且, 针对每一个目标基因, 都需要进行单独的探针设计, 这使得成本显著提高不少。
假如你要去开展基因表达分析, 又或者是进行单核苷酸多态性这一检测, 选用TaqMan会更加具有稳妥性。然而要是你仅仅是做一次初步筛选, 又或者是预算方面存在限制, 那么SYBR是完全能够满足使用需求的。
我个人所秉持的习惯在于: 首先借助SYBR去完成筛选工作, 之后运用TaqMan对关键结果予以验证。既能够节省费用, 又具备可靠性。
的确, 存在另外一种情形, 即你的样本格外复杂, 像是血液、痰液, 又或者是FFPE组织。在这种时刻, TaqMan的强大特异性便展现出优势来了。SYBR或许会出现怪异莫名的熔解峰, 致使你难以分辨究竟是目标产物还是二聚体。
仪器会不会也被你“用废”了？
我见过有人荧光定量PCR仪用三年没校准过一次。
仪器同样是需要进行维护的, 荧光强度是会伴随着时间而出现衰减现象的, 光学系统是有可能发生偏移情况的, 甚至加热模块的温度也是会出现不准确状况的, 这些问题并非会瞬间突然出现的, 它们是会一步一步、一点一点地来侵蚀你的数据质量的。
常常进行校准, 时常予以维护。基本上仪器生产厂家都会给出此项服务, 千万别节省这笔费用。
而且, 反应板或者管子的质量同样称得上很关键这件事情十分重要。质量差的管子具备透光性不强的这般一类特性, 荧光信号采集会由此出现问题。千万别在这种地方节省那么几十块钱, 否则你花费几千块钱所购买的试剂将会全部白白浪费掉。
曾经有一回, 我由于贪图便宜, 购买了一盒属于杂牌的管子, 结果呢, 针对同一批样本, 使用同一台机器, 所跑出来的那个Ct值, 竟然相差了2个循环。之后, 换上原装管子, 马上就变得正常了。
你说这是不是自找的？
其实做荧光定量PCR这件事，说到底就是：细节决定成败。
那些你认为“没什么要紧”的所在之处, 常常便是致使你出现差错的缘由。模板的浓度环节, 引物的设计环节, 标准曲线的相关环节, 染料的选择环节, 仪器的维护环节——每一个环节皆是丝毫马虎不得的。
你认真对待它，它才会给你靠谱的数据。
不信你试试。
