坦率讲, 当我头一回瞅见“感受态细胞”这四个字符之际, 脑袋里是空荡荡的。
是那种, 从实验室里的冷柜当中取出来的微小管子, 里面装着透明的液体, 标签上面印着几个由字母还有数字所构成的字符。老师讲, 这个东西价格昂贵。我在心里思索, 这个究竟能够用来做些什么事儿?
后来才知道，它是分子克隆里最基础也是最神奇的一步。
啥是感受态细胞，能用一句话说清吗
可以。它就是一群被打晕了的细菌。
并非是在开玩笑, 正常状态下的大肠杆菌, 生存情形颇为滋润, 具备自身的细胞壁, 拥有防御机制, 对于外来的DNA呈现出排斥的态势, 你若投入一段质粒进去, 它会将其当作垃圾给你吐出来。
但感受态细胞不一样。
它们经过了处理, 一般是先用氯化钙溶液浸泡一番, 接着放置到冰上进行冷冻, 随后再给予热激处理。经历了这一系列操作后, 细菌的细胞膜变得极为松弛, 恰似醉意朦胧之人, 大门完全敞开, 对他人所言一概听从。
这时候你把质粒加进去，它就傻乎乎地吞进去了。
为什么你做的转化总是不长菌
我懂你。
将平板取出来, 涂抹了菌液之后, 放置到培养箱进行过夜处理。到了第二天, 满心欢喜地急忙跑过去查看 , 结果却是空的。有一块板子 , 干干净净的 , 比我的实验记录还要白呢！
心态直接崩。
我踩过的坑，列几个给你，你看看中了几个：
已经解冻过度的感受态细胞, 是从零下八十摄氏度的环境中取出的, 取出后必须放置在冰块上使其缓慢解冻, 切不可为求速度用手捂着解冻, 也不可放置在室温环境中解冻, 因为那些细胞极其娇弱, 一旦温度升高, 其活性和转化效率便会丧失。
热激之时的温度并非足够精准无误。于42℃的环境里进行水浴操作, 历经45秒时间, 不多一秒亦不少一秒。倘若温度偏低, 那么膜便无法打开；要是温度偏高, 细胞就会直接死亡。
添加质粒之际未进行充分混匀, 只需轻缓地用手指弹击几下管底便可, 切勿使用涡旋振荡器操作, 忌采用吹打方式, 具体行动须保持轻柔温和, 仿若在悉心地哄着婴儿入眠一样。
复苏的时长实在是过于短暂, 完成加入LB培养基这一步骤之后, 必须要将其放置到37℃的摇床当中, 持续摇晃45至60分钟, 这既定的时间段是给予细菌充分时间去表达抗性基因, 若尚未达到足够的表达程度便进行涂板操作, 那么一旦抗生素被添加进来, 所有细菌都会死亡。
感受态细胞到底该买贵的还是便宜的
这个问题我问过很多师兄师姐。
有人讲, 选购价格最为昂贵的, 能确保稳妥。有人论, 价格较为低廉的已然能够满足使用需求了, 将剩余的资金拿去购买奶茶难道不美妙吗?
我的建议是——看你做什么实验。
假如仅仅只是去进行一个普通的亚克隆操作, 将一段基因连接到T载体之上, 再把它转化到DH5α当中, 价格便宜的那种完全能够满足使用需求。其效率达到10的7次方就算是符合标准了。
不过呢, 要是你打算去进行文库构建, 或者面对那些格外长的质粒（长度超过10kb）, 又或者着手做那种精细的定点突变, 那一定别去节省那部分费用。去购买商业化的超级感受态, 其效率能够达到10^9甚至还要更高。节省下来的时间以及精力, 比起你节省下来的那几百块钱可要值钱得多了。
别忘了感受态细胞的“性格”
它是有性格的。
有一些菌株, 像是DH5α, 适宜被用来储存质粒、进行质粒的扩增, 它生长得快, 转化效率高, 然而用于做蛋白表达却是不行的。
存有一些菌株, 像BL21这般的, 是特地用以表达蛋白的, 它能够高效率地表达外源蛋白, 然而要是你把它用于做克隆, 它会使你感到苦恼的, 因为其重组效率实在是太低了。
另有一个冷门的, 名为STBL3, 它专门用于对付那些重复序列数量较多、结构繁杂的质粒。普通的菌株会将它们进行重组, 处理掉可是STBL3却不会这样做。
转化操作里最容易被忽略的细节
讲一个我自己翻过的车。
曾有一回进行转化操作, 热激完毕后添加培养基予以复苏, 接着开展涂板操作。彼时, 实验室的涂布棒被师兄借走了, 我选用玻璃棒进行操作, 未经过灭菌便直接使用了。
结果一整块板子长满了菌落，但不是我要的转化子——全是杂菌。
有一次呢, 我在酒精灯尚未熄灭之际就开始涂板, 气流致使菌液被吹得到处都是, 板子上出现一大块一大块的空白区域哟句号。
这些都是很低级的错误，但你越忙的时候越容易犯。
转化后的菌落，怎么判断是不是真的阳性
长出来的菌落，不一定是真的。
可能是空载体自连，可能是非特异性片段接入，甚至可能是污染。
因而, 绝对不能一看到菌落, 就满心欢喜地直接进行摇菌提质粒操作。你须开展菌落PCR验证工作, 或者挑选几个菌落进行摇菌, 提完质粒后做酶切观察一番。
此外, 进行挑菌落操作之际, 需挑选那种单个的, 呈现圆润状态的, 并且大小保持均匀一致的。而那些生长得模样奇特怪异的, 体积格外小的, 以及连接成一片的, 切莫去触碰。
最后说点实话
第一次使用感受态细胞这种东西时, 你或许会心跳得厉害, 第二次使用时, 你会稍微有一些头绪, 第三次使用时, 你就开始抱怨它价格昂贵了。
但它真的是分子生物学里最温柔的陪伴。
给它一段DNA, 它会帮你变为成千上万个拷贝。养它一夜, 它会还你满满一管质粒。它从不已怨, 从不怠偷, 只要操作正确, 它肯定会给你长出东西来。
那些持续做实验直至深夜的特定日子, 是感受态细胞始终在陪伴着你。那些别人无法达成, 而你一做就成功的瞬间时刻, 同样是它在给予你助力。
所以，认真对待每一个小管子。
它很小，但它值得你温柔以待。
