我其实挺烦那些把ELISA讲得玄乎其玄的文章的。
怎么个“非得精准到小数点之后的三位”、“温育的时间差哪怕一分钟都不行就全完了”…属实讲啊, 搞实验的那些人都明白, 好多时候我们就是依照着说明书去实行完成的, 然而最终呈现的情况就是不怎么好看。要么背景高到底就仿佛墙纸一般的, 要么标准曲线弯曲曲折就跟玩的过山车那样的。
说起来, 我做ELISA做了大概几百次。一开始的时候手忙脚乱, 到后来闭着眼睛都能够顺利搞定。在这中间踩过的种种坑, 真的可以写出一本书来。今天, 不说那些虚头巴脑的, 咱们就聊聊实际的真东西。
洗涤这一步被严重低估了
确实如此。好多人认为只要加样加得准确无误就可以了, 至于洗涤, 难道不就是简单地甩动两下然后倒掉就算完成了吗? 其实这种想法是完全错误的。
ELISA里, 洗涤是最易被忽视却又最为关键的一环, 想象一下, 你好不容易封闭好的板子, 未洗干净的残留物会将非特异性结合带至天上, 特别是手工洗涤时, 别偷懒, 每次拍板要拍干, 可别拍得太狠把板底拍裂了, 这事我真做过, 欲哭无泪。
现如今, 我的习惯这般: 每一回进行洗涤, 起码得有五次, 在拍板之际, 换上洁净无污染的吸水纸, 切不可使用同一张纸张来回反复地蹭来蹭去。
温育时间真的不是越长越好
你看过那些“温育过夜”的推荐吧？我试过，背景高得没法看。
往后发觉, 实际上大多多数ELISA的温育时间存在一个最佳窗口。举例来说, 37度进行温育一小时的做法与4度留宿的情况有着全然不同之处。温度越高, 其所引发的反应速率越快, 但凡, 非特异性结合情况也会随着加速。倘若你所面临的背景始终居高不下, 不妨尝试缩短温育时间, 或者降低温度。
提及温度, 板子不可刚从冰箱拿出便直接使用, 需等其回升到室温, 不然加样之际冷凝水会对加样体积造成影响。
标曲老是做不好？换换稀释液试试
这个真的是血泪教训。
起初, 我采用PBS对标准品予以稀释, 然而, 制作出来的标曲无论怎样都不尽如人意。随后, 我更换为含有BSA的稀释液, 其效果瞬间产生了显著变化。切莫轻视这一微不足道的细节, 有时, 出现问题并非来源于你的操作, 而是归因于稀释液之中的成分对于蛋白稳定性所造成的影响。
另外, 在进行稀释操作之时, 务必要做到充分地均匀混合, 千万不要偷懒仅仅进行两次吸打动作。我这边通常会选择吸打次数不少于十次, 而且每一次都要更换枪头。这样听起来似乎存在浪费情况, 然而相较于重复去做实验, 却能够节省更多的时间。
加样手法比你想的重要
在加样之时, 倘若枪头伸进去的深度过深, 又或者碰到了板底, 那么均会对结果产生影响, 你知晓吗?
是这样的, 我的经验是, 枪头要悬在液面上方, 且距离液面只有一点点, 然后垂直向下加, 过程中千万不要碰到孔壁, 也一定不该碰到板底。加完之后, 要轻轻敲击板的侧壁, 以此让液体能够均匀铺开。这乍一听起来仿佛是一项基本功, 然而实际上真的有好多人做不到应然的到位程度。
此外, 加样的顺序同样需要保持固定, 举例来说, 要先添加标准品紧接着再添加样品, 而万万不可在今天采用此一顺序以及在明天又采用彼一顺序, 因为时间差也会对反应一致性造成影响。
读数前别忘了这一步
许多人在添加完终止液之后, 就赶忙着急去读板。实际上, 添加终止液以後, 需要等待几分钟, 使得颜色稳定下来。但也不可以等待过长时间, 因为时间一长, 颜色就会褪去。
我通常在添加完终止液之后, 会轻轻地对板子进行震荡, 以此来确认其已经实现了充分混匀, 之后等待5分钟再进行读数, 这样的时间段相对而言是比较稳妥的。
实话说来, ELISA此项技术呈现出一种状况, 即若言简单, 的确存在简单之处, 若说困难, 也明确有着困难之点。其简单在于, 步骤的数量就是那般多。其困难在于, 这每一步里面都存在着具体的细节。然而, 这些细节, 通常而言恰恰就是决定实验结果成功或者失败的关键所在之处啊。
莫要过度迷信那些繁杂且复杂的优化方案, 先将基础操作踏实地做好, 你便会发觉许多问题自然而然地就得到解决了。
做实验嘛，有时候就是跟自己较劲。但较劲的方向要对。
