我盯着培养瓶看了半小时，细胞就是不长。
那种感觉, 恰似你追了三个月之久的人, 忽然宣称“我们不合适”, 白白耗费功夫。全部实验均已完成, 耐药细胞株也已然建立起来, IC50也已测定, 论文也撰写好了。然而你可有否思索过一个问题——你所构建的这个耐药株, 它当真“抗药”吗?
或者说，它只是“暂时不想死”？
耐药细胞株到底是个啥
说白了，就是把原本敏感的细胞，泡在药里，泡到它不怕了。
会如同人饮酒那般, 起初一杯就倒下, 喝得多了就成了三斤哥之态。细胞亦是如此, 缓缓添加药物, 缓缓煎熬, 熬至它面对药物毫无反应。此时你手中所拿之的, 便是那所说的耐药细胞株了。
但这里头有个坑。
好多人待到这一步便止住了。哎唷, 我成功建成, 满心欢喜, 着手去写文章。而后投送出去却被审稿之人斥责回来: 你究竟凭借什么表明它具备耐药性? 你检测了些什么? 无非就测了个IC50?
怎么确定它真的耐药了
不只是看IC50升高了多少倍。真的。
今天你对IC50进行测量, 其数值变高了一百倍, 于是你兴奋得欢蹦起来。到了后天再次测量时, 数值又降回到原来的水平。这究竟是为何呢? 原因在于细胞处于不断变化之中, 你所使用的药物批次存有差异, 甚至仅仅你更换了一个培养箱, 最终所呈现的结果都会各不相同。
我说这些不是吓你。
真正靠扎实靠谱的验证, 通常得满足好些条件: 其一, 耐药程度所对应的数值指数需要保持稳定, 并非那种仅发生一次就结束的情况；其二, 得能观察到细胞在有药物存在这种状况下实实在在地能够存活并且生长, 而不是仅仅勉强支撑着不会死掉；其三, 较为理想的是要有一个可供参照比较的对象, 具体讲也就是你原本的具有敏感性的菌株。
这样才敢说，嗯，这个株应该是稳了。
为什么你的耐药株总是不稳定
这个问题我问过很多人。
实验室里的小王, 做了三个月耐药株, 到了第四个月的时候, 突然就不抗药了, 他一气之下把培养瓶给砸了, 随后重新开始做, 这又花费了三个月的时间。后来经过仔细探究发现, 问题竟然出在“停药”这件事情上面。
诸多的人在建好耐药株之后, 自认为已然大功告成, 于是便将药停了下来。细胞为此感到开心呀, 因为没有了压力, 便渐渐发生了变化, 又变回原来的样子了。如同你进行减肥时, 一旦教练离开, 你便又再度开始吃夜宵了。
所以，耐药株的培养液里，最好一直保持低浓度的药。
但并非所有的药都适合如此来做, 有些药长时间存在会发生降解, 有些药会出现光解的情况, 有些药则会产生沉淀现象, 你必须要弄明白你的药在培养条件之下能够保持稳定的时长是多久，不然即便添加了也毫无意义。
耐药机制到底要不要做
这得分人。
要是你从事基础研究方面的工作, 人家必然会询问你关于机制的情况? 然而设想一下, 鉴于倘若你投身于应用或者筛选药物的相关事宜, 机制实际上并没有那么迫切需要关注。老实讲, 存在许多人, 他们致力于研究耐药机制长达十几年时间, 最终却并未产出有实用价值的成果。
但问题是，审稿人要看啊。
那你就必须得做成, 起码要对耐药相关基因的表达进行一下检测, 像MDR1、MRP、BCRP这些, 要是有可能的话, 去做个流式来检测一下药物外排情况, 要是外排出现了增加的状况, 那很大概率就是ABC转运体在从中作祟了。
固然, 存在一种可能性, 即此情形与外排并无关联, 乃是细胞凋亡的路径发生了改变。处于这种情形时, 状况会更为棘手, 你需要针对每个路径加以查找。
我觉得吧，先做个外排实验，简单快速，能排除一大半问题。
耐药细胞株能用来做啥
很多人以为耐药株就是用来写论文的。
并非如此, 它具备各种各样的用途, 举例来说譬如能应用它展开可以逆转了耐药现象的化合物的筛选工作之举。当前而言这个特定的方向显得颇为火爆, 缘由于耐药现象构成临床领域凸显重要严重问题状况。万一你恰巧找到了某一个化合物, 此化合物能够促使耐药的菌株再度转变成拥有敏感特性的菌株, 那么这样的一个化合物便相应地具备着转化将其开发演绎成为有助于治疗辅助用途药物的发展潜力了。
也能够用以探究耐药之后的细胞生物学行为方面的变化, 有一些细胞在耐受药物以后, 变得愈发具备转移能力, 愈发拥有侵袭能力，此类情况便是所谓的“耐药 - 转移联动”, 这个研究方向同样极具开展价值。
再不然你仅仅凭借它去证实你新近合成的药是不是具备效果, 先是针对敏感株进行测试, 然后才针对耐药株展开实验, 如果呈现出活性, 那就表明你的药极有可能避开了耐药机制。
关于建株的一些小细节
啊对了，差点忘了一个事。
在建立植株的时候, 尽可能不要使用DMSO去溶解药物, 因为DMSO对于细胞具有毒性, 它会对实验结果产生干扰, 要是实在没有办法而使用了的话, DMSO的最终浓度最好将其控制在0.1%以下。
还有，加药梯度不要太快。
存在一部分人有着急性子, 于今日添加1μM, 在明日便加到10μM, 细胞是以径直死去呈现给你瞧, 得要慢慢地进行, 得让细胞去适应, 通常是添加一个浓度, 待细胞生长稳定了, 接着去增加, 此一过程或许会持续几个月, 着急不来的。
你还是得接受一个事实
不是所有细胞都能建成耐药株的。
存有一些细胞恰似软骨头, 一旦添加药物便会死亡, 历经更换多种方法均无法构建成功, 处于这般情形该如何处置? 尝试更换细胞系, 或者尝试更换药物, 可千万不要一味死磕。
我曾见识过一位极为凄惨的师兄, 他耗费一年光阴去构建一个肺癌细胞的耐药株, 然而当构建至第五个月时, 细胞却全部死亡了。于是他选择从头再来, 结果细胞再次死亡。最终经过探寻才发觉, 这个细胞系自身就格外脆弱, 根本承受不了长期的药物刺激。
后来换了另一个细胞系，三个月就建好了。
所以有时候不是你不行，是细胞不行。
写到最后
其实, 去做耐药细胞株这一事情, 讲难的话它是存在难点的, 提及易也有其容易之处的。难的地方在于需要具备耐心, 那些简单的因素则是操作层面。只要你, 能够忍受住性子, 把控好细节方面, 总归是能够把它做出来的。
但做出来之后，别忘了好好验证它。
不然你费了几个月的心血，可能只是一场空。
