平实地讲, 头一回听闻“酶标记抗体”这五个字词的时候, 我的脑袋里瞬间浮现出来的画面便是——。
一堆模样奇特怪异的蛋白质, 有个被称作“酶”的东西骑在了另一个名为“抗体”的东西的肩膀之上, 这俩家伙凑在一起打算去做些不能见光的事儿……
行吧, 我得承认那时我的想法出现了偏差。然而后续通过自身去开展实验操作, 这才弄清楚该物品究竟具备怎样高的好用程度。就在今日要与你讲讲, 何为酶标记抗体, 它究竟是以何种方式进行运作的, 还有为何你会对它产生依赖。
为啥做实验总绕不开它？
你可能跟我一样，最开始接触这玩意儿是因为ELISA。
ELISA, 是那种整日被师兄师姐老是挂在嘴边提及的, 听起来格外高大上的检测方法。然而实际上说白了, 它是依靠酶标记抗体去“寻觅东西”的。
你将样品放置于板子之上, 板子之中存在着你期望检测的抗原, 诸如特定的某种蛋白、病毒、激素类似的物质。随后添加酶标记的抗体, 此抗体犹如一名训练有素的警犬那般, 专门致力于捕捉那个抗原。待其捕捉到之后, 再加入底物, 酶会将底物转变为带有颜色的物质。颜色越深, 表明所存在的抗原数量越多。
简单吧？但真正做起来，有时候真的让人抓狂。
怎么挑对酶和抗体？别瞎配
这问题, 在咱首次开展做实验之际, 我便已然想要询问, 然而满心羞涩, 难以启口, 生怕展现出自身并非具备专业知识的形象。随后得以发觉, 就连实验室当中的资深博士后, 竟然也会遭遇失误。
辣根过氧化物酶（HRP）与碱性磷酸酶（AP）, 此二者乃是最为常见的搭配。HRP 之于大多数状况下, 皆是最为优先的选择, 其缘由在于价格低廉, 且稳定性颇为良好, 同时灵敏度亦是颇高。然而, 一旦你所进行的是免疫组化或者原位杂交操作, AP 在某些情形下反而会更为适用, 这是由于它所生成的信号并不容易出现散射现象, 从而在定位上更为精准。
还有，抗体的特异性太重要了。
第一批我买到的二抗, 宣称是专门针对小鼠IgG的, 做完没想到背景居然比目标还要深, 白花花的板子全都变黄了。后来换了另一家公司的, 这才把问题给解决掉。所以不要觉得贵, 抗体这类东西, 价值高低和价格是成正比的。
标记方法怎么选？直接法和间接法到底差在哪？
直接法是这样的, 你一开始的时候, 就去采用酶标记的一抗, 一下子就达成目的, 速度方面很快, 而且步骤数量比较少, 然而信号也许是不够强烈的。
那就来说说间接法, 首先要用未标记的一抗去捕捉抗原, 之后再添加酶标记的二抗去抓取一抗。信号就此得到了放大, 步骤增多了, 然而灵敏度却高了许多。
刚着手弄实验那会儿, 导师吩咐我采用间接法, 然而我嫌其费事儿, 背地里尝试了直接法。至于结果嘛……那信号比我期末的成绩还要糟糕。随后乖乖地再度运用间接法, 成效立刻就显现出来了。
为什么有时候信号好，有时候信号差？
这事儿太常见了，我实验室里的笔记都快翻烂了才找到原因。
极为寻常的缘由——清洗未达到彻底的程度。在你添加上抗体以后又进行孵育操作, 然而并未洗净, 残留下来的酶标记抗体就在底物上造成了混乱, 致使背景就此显现出来了。有一次我经历了要反复清洗五次之后才将相应背景压制下去, 实在是把人累坏了。
另有一缘由在于, 抗体浓度存在问题。浓度太低, 无法捕获抗原；浓度太高, 又会引发非特异性结合。最为妥当的方式是开展梯度稀释预实验, 不要嫌耗费时间, 这一步骤不能省略。
底物的挑选同样是相当关键的。TMB乃是ELISA的标准配置, 然而要是你所进行的是化学发光操作, 那就务必要将其更换为发光底物。千万别为了贪图省钱而去购置质量低劣的底物, 否则反应会不稳定, 数据也会没法看。
酶标抗体能用在哪些地方？不止ELISA
很多人以为酶标抗体只做ELISA，其实远远不止。
免疫组化（IHC）, 其是运用酶标抗体从而于组织切片之上对目标蛋白实现定位, 其中HRP添加DAB底物, 最终显现出来的棕色颗粒给人一种格外能带来满足之感的视觉呈现。
在进行Western blot时, 于转膜完成之后, 将酶标二抗施加上去, 随后显影而呈现出来的那些条带, 便是你历经辛苦跑胶所收获的成果。
免疫细胞化学, 斑点杂交, 组织芯片等等, 只要你需要对于特定分子进行检测, 酶标抗体基本上全都能够发挥作用。
新手最容易犯的错
我自己踩过的坑，说出来你可能想笑。
头一回进行ELISA操作, 板子封闭状况未达标, 于孵育期间其中的水分蒸发掉了, 最终致使孔里变得干涸, 将其拿出观察时, 竟毫无信号呈现, 白白地耗费了半天时间。
又有一回, 收完抗体之后, 忘记把它放置到4℃的冰箱里, 到了第二天, 发现酶已经失活了, 于是又不得不重新去做。
并且, 切勿信赖那些过期的抗体, 你若舍不得丢弃, 它便会在关键的时刻, 给予你教训——通常的时候是呈现无色那般。
除了经典方法，还有新玩法吗？
现有诸多商品化的酶标记抗体, 拿来直接用便行, 省心省力。然而倘若你打算自行制作, 也能够购置标记试剂盒, 其操作起来算不上极为繁杂。
还有另外一些新技术, 比如说多酶标记系统, 在一个抗体之上携带好几个酶分子, 信号放大的程度十分惊人, 适宜用于检测极低丰度的目标。
然而说实话, 对于多数实验来讲, 传统的HRP或者AP体系已然足够用了。不要被那些花里胡哨的新技术给绕得晕头转向了。
最后一点感想
做实验这么多年，我跟酶标记抗体算是老熟人了。
它并非是那种有着高深莫测性质的事物, 仅仅只是一个工具而已。然而要是能够将它运用得当, 它便能够助力我们去看到那些无法看得见的分子, 从而使得那些隐匿起来的信号呈现出来。
有些情况下失败是源于操作未能足够细致严密, 有些时候是由于试剂存在不够理想的状况, 另外有些时段则是运气欠佳所致。然而不要气馁沮丧, 增加尝试的次数, 终究能够寻得一定的体会认知与感觉把握。
那一天, 我做出了一组漂亮的梯度曲线, 这些曲线的颜色, 从深到浅排列得整整齐齐, 那种感觉, 比享用了一顿丰盛美味的餐食还要令人畅快。
那样子了, 便谈到此处啦。怀有期望你在接下来一回进行实验之际, 酶标抗体能够顺遂地与你展开协作, 不要无端生出些麻烦波折来。
