讲真, 我最初头一回碰到快速PCR扩增试剂盒之际, 心里是存有疑虑的。
能够真的做到快速, 快速呈现出来的事物准确与否。千万别弄到结尾的时候还必须再次运行一回, 那样的话可就白费力气了。
在实验室当中, 时间等同于金钱, 特别是当样品堆积如山之际。你注视着那台PCR仪, 内心思索的是能否尽早下班, 又或者在下午之前将数据提交上去。
但这种焦虑，很多人不说。
快速扩增真的靠谱吗？
我刚开始也不信。
就传统的PCR而言, 跑一个循环, 两三个小时就过去了, 你得等, 要等一遭, 再等一阵, 等的时候做什么呢? 是刷手机吗? 可心里又觉得不踏实。
快速PCR扩增试剂盒宣称能够将时间压缩至30分钟乃至更短, 听起来好似是骗人的。
但是随后进行了尝试, 发觉确实并非是噱头。关键之处在于它的酶, 也就是那些经过改造的聚合酶, 并非是寻常之物。它们奔跑速度快, 并且不容易出现差错。
当然，前提是你得选对厂家。
有那么些牌子, 价格方面确实是挺便宜的, 然而其扩增曲线呈现出类似心电图的形态, 呈现出锯齿状模样, 让人望去心里难免就会感到慌张。
为啥有人用快速试剂盒反而翻车？
说实话，翻车不是试剂盒的问题，是人的问题。
我见到过最为夸张的一种情形, 有这般一个人, 将模板浓度弄得特别之高, 心里觉得如此这般便能够更快速地得出最终结果。然而实际状况又是怎样的呢? 非特异性扩增现象到处皆是, 在胶图之上全部都是杂乱的条带。
你怪试剂盒？试剂盒冤枉啊。
速度提升了的那种酶涉及的快速PCR扩增试剂盒的设计逻辑是, 你的反应体系需要进行相应调整, 引物浓度要重新优化, 退火温度也要重新优化, 循环数同样得开展重新优化, 不是把传统PCR的那一套参数直接去套用。
竟然还有人贪图速度快, 将循环数设置得极为特别少, 自认为反正酶的速度跑得飞快, 觉得25个循环已然完全足够了, 结果却致使产物量处于不够的状况, 使得下游实验根本就没有办法去开展进行。
所以，不是试剂盒的问题，是你没摸透它的脾气。
同一个试剂盒，为啥有人用得好有人用不好？
这问题我也想了好久。
随后发觉, 重点在于, 你是否切实领会了“快速”这两个字词所蕴含的代价 ；是不是真真切切地明白了那代价 , 这才是关键所在。
用于快速PCR扩增试剂盒的酶, 一般而言都是历经定向进化的产物, 其延伸速度相较于普通Taq酶而言, 可达几倍乃至十几倍之多。然而代价究竟是什么呀? 那便是热稳定性或许会稍微差那么一点儿, 又或者是对抑制物的耐受性没有那么强。
存在乙醇残留, 致使在你所提取的样本出现不干净的状况, 对于普通PCR而言还能够承受, 然而快速PCR却直接停止工作。
所以，那些用得好的实验室，都有一个共同点：模板质量过硬。
你不要去节省那仅仅几分钟的提取之时辰, 节省出来的那些时间, 最终都极有可能白白耗费在反复进行的实验当中。
怎么选？别光看参数
很多人选试剂盒，就看一个指标：时间。
30分钟？好，买。20分钟？更好，买。
可实际运用展开时, 发觉GC含量偏高的区域无法扩出, 或者长片段比方说5kb以上的根本跑不动啦。
你要看自己的实验需求。
若你所进行的仅仅是常规的鉴定, 片段长度为几百bp的那种, 那么绝大多数的快速试剂盒均可胜任此项工作。
然而要是你打算进行扩增GC-rich的区域, 或者是长片段, 那么就得挑选那些专门经过优化的。可别寄希望于一个能应对所有情况的万能之物来解决全部问题。
另外, 可别忘掉查看荧光染料的兼容性, 存在那种快速试剂盒, 仅仅适用于SYBR Green, 存在部分能兼容EvaGreen或者探针法。倘若你要进行qPCR, 这一点是极为重要的。
我亲身体验过那种踩坑的经历, 买下了快速试剂盒, 其说明书表明能够支持qPCR, 然而实际使用时, 重复性糟糕到了极点。随后经过查找, 发觉原因是缓冲液里的镁离子浓度与我的染料并不匹配。
别被“快”冲昏头脑
我知道，大家都想快。
老板催促着, 项目赶着进度, 论文的截止日期已然近在眼前, 你满心急切, 怀揣着恨不得让聚合酶链式反应在短短10秒之内就能够完成跑完的想法。
而是实际情况, 即便快速PCR扩增试剂盒速度再快, 那也是得依照基本的生物学规律的。其中变性这一步骤, 是需要耗费时间的, 退火阶段同样也要花费时间, 延伸这个环节当然也不能缺少时间。存在一些试剂盒宣称自己能够在10分钟以内完成40个循环, 你会相信不? 我曾经尝试过, 确实是有产物出现的, 然而其特异性糟糕到足以让你对人生都产生怀疑了。
快，不是唯一的指标。
就我而言, 更着重考量的是, 在确保速度得以维持的状况之下, 特异性以及灵敏度是否能够稳固。
部分试剂盒, 虽说速度稍慢些, 需15分钟才能跑完, 可条带清晰干净, 背景几乎不存在。如此情形反倒比那些被吹嘘得神乎其神的30秒循环试剂盒更具可靠性。
说白了，还是得试
我不信什么“全网最好”这种话。
你得自己试。
购买数个不一样牌子的快速PCR扩增试剂盒, 运用自己最为常借助的模板以及引物去跑上一遍, 瞅瞅哪一个的曲线会是最为精致好看的, 哪一个的Ct值会是最为稳定不变的, 哪一个的胶图会是最为洁净无杂质的。
别省那点试用装的钱。
一次试错，可能帮你省下后面几十次重复实验的时间。
与此同时, 要记着跑完以后开展个熔解曲线或者测序去验证一番。可别仅仅因为看到扩增曲线极为漂亮就认定一切都没问题了。我曾碰到过这样的情况——扩增曲线漂亮到了无懈可击的地步, 然而测序之后一看, 全都是非特异性的产物。
最后聊点实在的
现在市面上的快速PCR扩增试剂盒，技术已经很成熟了。
你不用担心它的可靠性。只要是大厂出品，基本都没问题。
关键是：你是不是真的会用。
这般模板, 其纯度究竟如何? 那些引物, 设计得是否甚是精妙? 退火温度, 有无进行优化? 这些作为基本功, 才是判定你能否去享受“快速”红利的关键所在。
不要妄图借助快速PCR试剂盒去填补实验设计存在的不足, 它仅仅是一把速度快的刀, 你手上必须有可供处理的内容, 方可切得顺利。
于是, 要是你此刻依旧在迟疑究竟要不要去更换, 我的提议便是: 去更换, 不过得先从开展小规模的试验着手。
找几个自己最头疼的模板，试试看。
如果效果好，再全面铺开。效果不好，换个牌子再试。
实验嘛，本来就是试出来的。和试剂盒过日子，也得磨合。
